为揭示尼罗罗非鱼Ikaros基因结构特征及其在抗病原感染中的免疫调控机制,实验采用RT-PCR和RACE方法克隆了尼罗罗非鱼Ikaros的cDNA序列以及利用PCR和染色体步移技术克隆了Ikaros的基因组DNA序列,通过荧光定量PCR分析了Ikaros mRNA的组织分布及其对无乳链球菌感染的响应.结果表明,克隆的尼罗罗非鱼Ikaros基因组DNA为20454 bp,包括7个内含子和8个外显子,经可变剪接可形成6种不同的mRNA剪接异构体,其编码的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的锌指结构域且与硬骨鱼类Ikaros氨基酸序列同源性较高(70.6％—93.7％).Ikaros基因在尼罗罗非鱼各组织中均有表达,在血液中的表达量最高,其次为胸腺、脾脏和头肾.人工感染无乳链球菌后,血液、胸腺、脾脏、头肾中Ikaros基因的相对表达量均显著上调,并在48h达到峰值,这表明Ikaros基因参与调控尼罗罗非鱼抵御无乳链球菌的免疫应答反应.研究可为进一步探索Ikaros基因在罗非鱼抗病原感染中的作用机制奠定理论基础.

通过生物信息学手段对9种硬骨鱼转座组进行注释.结果表明9种硬骨鱼类转座组大小和构成差异显著,其转座组含量从高到低分别为斑马鱼、矛尾鱼、青鲋鱼、罗非鱼、花斑剑尾鱼、大西洋鳕鱼、三刺鱼、金娃娃和红鳍东方鲀,转座子含量和基因组大小呈正相关.DNA转座子在硬骨鱼类中具有多样性高和含量差异大的特点(0.50％-38.37％),是硬骨鱼类转座组差异的主要决定因素,其中hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨鱼类主要的DNA转座子.RNA转座子在硬骨鱼类中也具有多样性高的特点,其中LINE转座子占硬骨鱼类基因组的0.53％-5.75％,共检测到14个超家族分布,其中L1、L2、RTE和Rex转座子扩增较为明显,LTR转座子除了在斑马鱼和三刺鱼中含量达到5.58％和2.51％,在大多硬骨鱼类基因组中的含量低于2％,在硬骨鱼类中共检测到6个LTR转座子(Copia、DIRS、ERV、Gypsy、Ngaro和Pao)超家族分布,其中扩增最为明显的是Gypsy.而SINE转座子在硬骨鱼类中扩增最弱,仅在斑马鱼和矛尾鱼中分别达到3.28％和5.64％,在其他7个物种中低于1％.SINE中tRNA、5S和MIR三个超家族在部分硬骨鱼类中有一定程度扩增.本研究表明硬骨鱼类转座组具有多样性丰富、差异大的特点,转座组差异与硬骨鱼基因组大小有很强的相关性,转座组是决定硬骨鱼基因组大小的重要因素.

为探究双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrhosum)卵黄蛋白原vtg基因的结构和表达特征,本研究运用RACE技术克隆双须骨舌鱼vtg全长cDNA序列.序列分析发现,双须骨舌鱼vtg的cDNA全长为5 325 bp,开放阅读框(ORF)为5 121 bp,其5 ′和3′非编码区(UTR)分别为46 bp和159 bp,共编码1 706个氨基酸,预测蛋白质分子量约为186.79 ku.同源性分析发现,双须骨舌鱼与同科的美丽仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度达到84.78％,与鲤形目、鲈形目、鲱形目、鲽形目鱼类的相似度均高于50％.系统进化树分析结果显示,本文获得的双须骨舌鱼vtg基因与骨舌鱼目聚为一类,与鳗鲡目硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符.荧光定量PCR检测结果表明,在雌雄鱼性腺和肝中vtg均有表达,且在雌鱼肝中的相对表达量显著高雄鱼(P＜0.05),卵巢和精巢表达量无显著差异(P＞0.05);在雌雄鱼鳃、脾、肾、肌肉、心、头肾、脑等7个组织中均极微量表达,且无显著差异(P＞ 0.05).在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢中vtg相对表达量依次增加,Ⅳ期显著高于Ⅱ和Ⅲ期(P＜0.05),也显著高于精巢Ⅳ期(P＜0.05);在雌鱼肝组织中呈先增后减趋势,且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期之间无显著差异(P＞0.05),但每个时期都显著高于雄性(P＜ 0.05).成功构建了原核表达载体pEASY-BluntE2-vtg,并转入Transetta(DE3)表达感受态细胞中成功诱导出融合蛋白.Western-blotting检测显示,融合蛋白可被抗His标签特异性识别.综上表明,vtg表达水平高低与性别相关,并与性腺发育程度有关.此外,本研究结果也为后续深入研究卵黄蛋白原的生理功能打下基础.

非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物.鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发的,可杀死多种靶细胞,例如同种异源或异种异源肿瘤细胞,寄生性原生动物和被病原侵染的细胞.NCCRP-1是NCC上的一种标志性受体.本研究对尼罗罗非鱼的脑,头肾,肝脏和脾脏进行切片,对NCCRP-1进行染色,通过免疫组化分析得知NCC在这些组织中的分布情况.另外采用Percoll非连续密度梯度法分离纯化得到头肾NCC,采用免疫组化染色和FITC标签标记,与组织中的染色结果分布相同.相较于qPCR等技术,本研究更直观地观察NCC在组织中的分布特点,为深入研究NCC的功能奠定了基础.

斯钙素(stanniocalcin,STC),是由硬骨鱼的内分泌腺分泌的一种糖蛋白激素.某些细胞信号传导通路或生物分子可能参与了STC2的表达调控及STC2促进肿瘤细胞增殖、迁移、耐药等相关机制;已有相关研究表明,STC2在多种恶性肿瘤细胞中异常表达,与肿瘤的增殖、迁移侵袭、治疗及预后等存在相关关系,预测STC2有潜力成为新的肿瘤标志物以用于恶性肿瘤的诊断及预后评估,并且成为恶性肿瘤治疗的新靶点.

斑马鱼( zebrafish)在脊椎动物基因功能的研究中得到广泛应用,并且越来越多地应用到人类遗传疾病的研究中.基因测序发现在直系同源基因中,47％的人类基因与斑马鱼直向同源物具有一对一的关系[1]. 此外,斑马鱼体形小、繁殖周期短,可在实验室中进行空间高效维护. 在硬骨鱼进化上的基因组重复导致两个旁系同源的斑马鱼酪氨酸羟化酶( tyrosine hydroxylase, TH)编码基因TH1和TH2,其中TH1主要分布在脑内, TH2 则主要分布在心脏、肝脏和肾脏[2]. 本实验制备了地高辛标记的斑马鱼TH2 RNA探针,采用斑马鱼整胚原位杂交技术在 96 h ( hours post fertilization,hpf)的胚胎中进行鉴定.

应用光学显微镜和透射电镜对斑马鱼(Danio rerio)脾的显微与超微结构进行了观察.光镜结果表明,斑马鱼的脾主要由脾髓和网状组织两部分构成,脾髓分布于整个脾,分为白髓和红髓,但界限不明显,呈混合分布.红髓染色相对较浅,占脾实质的大部分区域,主要由密集的红细胞构成,可见脾窦结构,脾索结构不明显.白髓染色较深,主要由密集的淋巴细胞构成,淋巴细胞的胞核染色较深,呈深紫色.经Gordon-Sweet银染显示网状纤维后,可清晰观察到脾小结,从而可清晰区分红髓与白髓,脾小结与哺乳动物的类似,主要是由密集的淋巴细胞构成.酸性磷酸酶染色可见斑马鱼脾内有大量吞噬性细胞存在.电镜结果显示,红髓分布有不同类型的红细胞、血小板和浆细胞,白髓分布有淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、浆细胞和网状细胞,淋巴细胞胞质内含有多泡体,这可能与淋巴细胞发挥免疫功能有着密切联系.斑马鱼脾与大多数硬骨鱼相似,未观察到椭球这一特殊结构.

同源基因家族的拷贝数在不同物种间普遍存在差异,这种差异是由不同的基因得失速率引起.众所周知,基因拷贝数变异是特定物种表型创新的可能原因.本研究选取具有代表性的脊椎动物主要类群并跨约6亿年进化时间的64个物种,鉴定了它们的同源基因家族,揭示了脊椎动物基因家族大小的进化模式.结果表明:在推断的存在于脊椎动物最近共同祖先的6857个基因家族中,有6712个都在至少一个种系中发生了大小的变化,而且基因家族在大多数种系中都是收缩的;其中,霍氏树懒(Choloepus hoffmanni)中有最高的基因家族收缩水平,而在斑马鱼(Danio rerio)中则相反.基于脊椎动物基因家族大小进化的高度动态性,本研究从基因家族大小变化的角度鉴定了一些可能与特定脊椎动物类群进化有关的基因组信号.结果观察到在现存真骨鱼类最近共同祖先基因组中出现了可能因全基因组复制所导致的高比例的基因家族扩增现象,随后在后裔物种中发生基因收缩事件.此外,本研究还发现了硬骨鱼特异性的orphan基因可能对这些鱼类在水生环境中的适应性进化有所贡献的证据,如在有些硬骨鱼中orphan基因与鳍、尾巴、肾脏等发育有关.本研究结果有助于深入了解脊椎动物基因家族大小的进化,同时为理解脊椎动物基因组进化与表型多样性的联系提供了理论证据.

为研究硬骨鱼类leptin基因表达与血糖之间的关系, 研究在禁食与胰岛素处理后, 检测鳜血糖和肝脏、肠道和脂肪组织leptin-A基因表达水平.在禁食实验中, 鳜被禁食10d, 并分别于禁食后0、4h、2d、6d和 10d取样.禁食后6d鳜血糖开始降低, 禁食后10d鳜血糖显著降低.同时, 禁食后6d鳜肝脏leptin-A基因 mRNA表达水平显著升高, 禁食后4h鳜肠道和脂肪组织leptin-A基因mRNA表达水平均显著升高.在胰岛素处理实验中, 分别于注射后12h和36h取样.腹腔注射胰岛素后12h, 鳜血糖显著降低, 而鳜肝脏、肠道和脂肪组织leptin-A基因mRNA表达水平无明显变化.腹腔注射insulin后36h, 鳜肠道leptin-A基因mRNA表达水平显著升高.研究结果表明, 长期禁食或胰岛素处理均能够降低鳜血糖水平, 且影响消化器官和脂肪储存器官leptin-A基因表达.

为阐明肠型脂肪酸结合蛋白基因(ifabp)在金钱鱼(Scatophagus argus)脂肪代谢中的作用,从金钱鱼肝脏转录组中得到ifabp的unigene片段,设计特异引物克隆了金钱鱼2种亚型ifabp基因(ssifabp2a和ssifabp2b),并分析了这2种基因在雌、雄鱼中的组织分布以及饥饿及复投喂后肝脏和肠道中的表达变化.聚类结果表明,ssifabp2a与其他硬骨鱼类Ifabp2a、Ifabp或IfabpX1聚为一类,ssifabp2b则与其他鱼类的Ifabp2b或Ifabp-like聚为一类.同源性比较发现,ssifabp2a与其他硬骨鱼类Ifabp2a、Ifabp或IfabpX1的同源性为78.8％—87.9％;ssifabp2b与其他硬骨鱼类Ifabp2b或Ifabp-like的同源性为79.5％—87.9％;ssifabp2a与ssifabp2b的同源性为73.5％.RT-PCR发现:在雄鱼中,ssifabp2a在小肠中表达最强,在肾和肝脏等表达较弱;ssifabp2b也在小肠中表达最强,在肝脏、胃和下丘脑等较弱.在雌鱼中,ssifabp2a在胃中表达最强,在肾、肝脏和下丘脑组织表达较弱,在其他组织中有微弱表达,脑垂体中没有检测到表达.与ssifabp2a表达情况不同,ssifabp2b在下丘脑、卵巢、心脏、肠中表达较强,其他组织中有微弱表达,鳃中没有检测到表达.饥饿及复投喂结果表明:在肠中,饥饿2d后,ssifabp2a表达量显著降低,ssifabp2b无显著性变化;饥饿7d后,ssifabp2a表达量显著下降,但ssifabp2b无显著性变化;在复投喂后,与7d饥饿相比较,ssifabp2a和ssifabp2b的表达量均显著升高.在肝脏中,饥饿2d后,ssifabp2a表达量无显著变化,而ssifabp2b的表达量显著升高;饥饿7d后,ssifabp2a和ssifabp2b的表达量均显著升高;在复投喂后,ssifabp2a和ssifabp2b表达均显著下降,恢复到正常水平.结果表明,饥饿及复投喂对金钱鱼肝脏和肠道中的ssifabp2a和ssifabp2b的表达具有显著影响,表明两者都参与了金钱鱼的脂肪代谢调节.