松墨天牛Monochamus alternatus是我国南方林区重要的蛀干害虫,也是我国重大林业外来入侵物种松材线虫Bursaphelenchus xylophilus的主要传播媒介.为探究热激蛋白HSP40在松墨天牛抵御高温胁迫中的功能,基于松墨天牛转录组数据(GenBank登录号:PRJNA548205),通过RT-PCR技术克隆两条松墨天牛HSP40基因,并对其进行生物信息学分析;使用MEGA 7.0软件构建松墨天牛HSP40系统进化树;利用RT-qPCR技术检测16日龄松墨天牛雌雄成虫各组织HSP40基因在不同温度与时间处理条件(35℃、37℃、40、42.5℃和45℃;0h、1 h、2 h和3 h)下和高温42.5℃处理3 h后的组织表达特性.结果表明:克隆获得松墨天牛两条HSP40基因MaltHSP40-l(GenBank 登录号:MW690168)和 MaltHSP40-2(GenBank 登录号:MW690169),其 ORF 长度分别为1 206 bp和1 059 bp,分别编码401个和352个氨基酸,分子质量分别约为45.24 kDa和39.25 kDa,等电点分别为6.73和9.07;两条序列中均存在含有保守的HPD基序以及DNA-J结构域;蛋白三维结构中均由N端的4个a螺旋和C端的底物结合域构成.系统进化树显示:MaltHSP40-1和MaltHSP40-2分别与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AglaHSP40-1和AglaHSP40-2遗传距离最近.RT-qPCR结果显示,高温胁迫可诱导松墨天牛HSP40基因的转录表达,雌雄成虫的MaltHSP40-1和MaltHSP40-2分别在35℃和37.5℃的条件下开始表达上调,在40℃或42.5℃时到达峰值,雄虫HSP40的相对表达量和上调倍数均高于雌虫;MaltHSP40-1及MaltHSP40-2在松墨天牛雌雄成虫的各组织中均有表达,42.5℃处理3 h后,MaltHSP40-l及MaltHSP40-2在各组织中的相对表达量均显著上调,精巢和卵巢中相对表达量最高.本研究表明McdltHSP40-l和MaltHSP40-2作为辅助分子伴侣,参与松墨天牛抵御高温胁迫.研究结果有助于深入探究热激蛋白在松墨天牛应对高温胁迫中的作用,也为揭示气候变暖背景下松墨天牛及松材线虫病的流行成灾机理提供理论依据.

苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是我国重大农业入侵害虫,对我国果业健康发展造成严重威胁.在利用基因编辑等技术对相关基因进行功能研究时,通常采用单对交配策略对纯合突变体进行筛选.因此,在配对前明确个体基因型,避免对虫体造成损伤尤为重要.本研究分别收集末龄幼虫蜕(10个蜕)和蛹壳(1个、5个、10个、15个蛹壳),通过基因组DNA提取、目的基因PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物测序,以评估该方法作为苹果蠹蛾基因检测的可行性.结果显示,以苹果蠹蛾末龄幼虫10个蜕及5个以上蛹壳提取的基因组DNA作为模板,扩增精巢特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Testis specific serine/threonine protein kinase,TSSK1)基因,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到单一、明亮的条带,经测序证实该产物是目的基因序列.基于高效及节约成本的原则,拟推荐利用10个末龄幼虫蜕或10个蛹壳提取基因组DNA、通过PCR扩增和测序进行苹果蠹蛾的无损伤基因型检测.本研究建立了一种利用幼虫蜕和蛹壳进行苹果蠹蛾无损伤、高效的基因检测方法,为提高苹果蠹蛾基因功能研究的效率奠定了基础.

研究以XX遗传型全雌黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco)群体为实验材料,利用加氢甲基睾酮(17α-meth-yldihydrotestosterone,MDHT)和来曲唑(Letrozole,LZ)对性别分化关键时期(12-60日龄)黄颡鱼幼鱼进行投喂处理,设置MH组(50 mg/kg MDHT)、ML组(10 mg/kg MDHT)、MH+L组(50 mg/kg MDHT,1000 mg/kg LZ)、ML+L组(10 mg/kg MDHT,1000 mg/kg LZ)及对照CR组(0 MDHT,0 LZ).结果显示,ML组和ML+L组雄性化个体比例较高,分别为66.7％和83.3％,其性腺类型包括间性性腺(37.5％和50.0％)和全精巢性腺(29.2％和33.3％),且两组中均获得了43.8％的功能性XX伪雄鱼.以XX伪雄鱼为父本、以经多代选育的全雌黄颡鱼为母本,进行规模化人工繁殖,获得了280万尾XX遗传型黄颡鱼苗种.在92日龄时发现,在室外池塘养殖条件下,98.0％的个体卵巢发育良好,2.0％的个体性逆转为非功能性XX伪雄鱼.研究建立了一套黄颡鱼全雌种群规模化繁育技术体系,为黄颡鱼规模化人工繁育与遗传改良、黄颡鱼产业健康可持续发展提供保障.

为探究胰岛素样促雄性腺激素(Insulin-like androgenic hormone,IAG)在甲壳动物性别分化过程作用的分子调控途径,挖掘与IAG蛋白存在互作关系的候选蛋白信息,研究使用红螯螯虾促雄性腺及输精管组织构建核体系酵母文库,利用酵母双杂交技术筛选与IAG互作的候选蛋白,并对关键候选蛋白的编码基因进行克隆与表达分析.获得初级文库容量为1.12×107,次级文库容量为1.28×107;成功筛选到25个阳性克隆,共注释到12个蛋白编码基因;克隆获得关键候选蛋白的编码基因muc5acl(Mucin-5AC-like)的CDS全长474 bp;半定量与荧光定量表达结果表明,muc5acl在红螯螯虾的促雄性腺、精巢及输精管中特异表达,且在雄性个体促雄性腺中的表达水平显著高于间性,在输精管中的表达则相反,推测该基因可能参与雄性激素的分泌及精子运输过程,并与间性红螯螯虾的性腺发育有关.研究结果将为进一步解析IAG调控红螯螯虾间性性别形成的分子机制提供重要信息.

[目的]羧酸酯酶(carboxylesterases,CCEs)是一类重要的水解酶超家族,参与昆虫体内各种外源物质的代谢过程.本研究利用不同发育阶段、不同组织和吸血前后中华按蚊Anopheles sinensis的转录组数据分析CCE基因表达模式,为进一步研究CCEs在不同生理过程中的潜在功能奠定基础.[方法]以前期从中华按蚊实验室品系转录组数据库中筛选出的50个CCE基因,利用生物信息学分析其在中华按蚊不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊不同组织(触角、唾液腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪体)中以及雌成蚊吸血前和吸血后不同时间(1,3,6,12,24和48 h)的表达模式.[结果]CCE基因主要在幼虫或成蚊阶段高表达或特异性表达;AsAe12,AsAe4和AsBe4在所有发育阶段均高表达.CCE基因的表达具有组织特异性,主要集中在成蚊触角、表皮和精巢中表达;此外,5个CCE基因(AsAe13,AsAe12,AsAe6,AsAe4和AsBe4)在成蚊中肠、马氏管和脂肪体中均高表达,可能与这些解毒器官代谢异生物有关.在雌成蚊吸血后,大多数CCE基因的表达量发生了变化,它们的表达模式也存在差异,这表明血液消化是一个复杂的过程.[结论]本研究结果丰富了中华按蚊CCE基因的知识,为深入探究CCE家族基因在中华按蚊生长发育中的的潜在功能提供有价值的参考.

[目的]为了更好地利用性信息素进行番茄潜叶蛾Tuta absoluta的测报和防控,深入研究其运动、求偶和交配行为的昼夜节律.[方法]针对番茄潜叶蛾成虫,采用视频记录和二维轨迹分析其运动;固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)吸附提取和气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析雌成虫性信息素滴度;2022年8-9月在四川省西昌市番茄大棚开展番茄潜叶蛾田间诱捕试验,根据诱捕结果分析番茄潜叶蛾成虫性信息素滴度与日龄和昼夜节律的关系,室内养虫笼内观察交配行为,并抽样解剖观察分析番茄潜叶蛾雄成虫的生殖系统发育与日龄关系.[结果]结果表明,在室内环境下,雌雄成虫的运动发生在暗期第5小时开始至光期第2小时结束,但进入暗期第5-7小时为高峰期,其运动时间和距离在雌雄及所测日龄(1-7日龄)之间均没有显著差异.番茄潜叶蛾的性信息素在1-11日龄成虫中都能检测到,日龄之间性信息素滴度没有显著差异.雌成虫性信息素在整个24 h内都可检测到,且不同时段之间信息素滴度差异不显著.交配没有显著影响雌成虫性信息素滴度.田间雄成虫被诱捕到的时间段在暗期第7小时至光期第2小时.番茄潜叶蛾成虫羽化当天就可以交配,交配率在3日龄为最高,之后则下降,交配持续时间在日龄之间没有显著差异.交配的高峰期则发生在暗期第7和10小时,进入光期之后则无新增的交配.雄成虫精巢体积随着日龄的增加而减少,依据性诱雄成虫的体积大小推算其日龄在3-7日龄.[结论]番茄潜叶蛾成虫的求偶和交配时间发生在暗期的末段,雌成虫性信息素滴度在不同日龄和昼夜节律保持持续的高水平,交配也不影响性信息素滴度.性诱雄成虫的年龄偏大,其精巢体积与7日龄的一致,多数可能已经交配.研究结果为不仅深入了解了番茄潜叶蛾成虫的求偶和交配行为,而且为开发基于性信息素的防控技术提供依据.

[目的]探明茶小绿叶蝉Empoasca flavescens粘样蛋白EfMLP基因的分子特征、表达模式和生物学功能.[方法]基于茶小绿叶蝉转录组数据,PCR克隆获得4条EfMLP基因的全长cDNA序列并进行生物信息学分析;qRT-PCR检测EfMLP基因在茶小绿叶蝉不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)及初羽化成虫不同组织(体壁、脂肪体、唾液腺、肠道、卵巢和精巢)中的表达量;通过饲喂法利用RNAi沉默茶小绿叶蝉5龄若虫EfMLP2和EfMLP4,生物测定分析EfMLP基因沉默后茶小绿叶蝉的存活率.[结果]获得4条茶小绿叶蝉EfMLP基因全长cDNA序列,分别命名为 EfMLP1(GenBank 登录号:OR504428),EfMLP2(GenBank 登录号:OR504429),EfMLP3(GenBank 登录号:OR504430)和 EfMLP4(GenBank 登录号:OR504431),这4 条 EfMLP 基因编码蛋白均具有O-联糖基化位点形成粘蛋白结构域(mucin domain,MD)且该结构域包含高度重复的串联重复序列,其中EfMLP3和EfMLP4的氨基酸序列含有保守的2型几丁质结合域(chitin binding domain,CBD).系统发育分析结果表明,EfMLP被分到两个不同的分支上,属于两种不同的MLP类型,该结果与昆虫的分类地位无相关性,猜测可能与其功能分化相关.EfMLP1和EfMLP2在茶小绿叶蝉初羽化雌雄成虫和初羽化成虫唾液腺中均特异性高表达,而EfMLP3和EfMLP4的表达在卵、若虫和成虫等不同发育阶段和初羽化成虫脂肪体等多个组织中均可被检测到.与饲喂dsGFP对照组比较,饲喂dsEfMLP2和dsEfMLP4可分别有效抑制茶小绿叶蝉体内EfMLP2和EfMLP4的表达量,并可显著降低茶小绿叶蝉的存活率.[结论]EfMLP在茶小绿叶蝉取食中扮演重要的角色,可作为开发基于RNAi的叶蝉防治技术的潜在靶标.

柑橘大实蝇Bactrocera minax(Enderlein),是柑橘的重要害虫.本文基于光学显微镜、扫描电镜、石蜡切片观察,对柑橘大实蝇的内生殖系统形态结构进行研究.结果表明,柑橘大实蝇雌虫内生殖系统主要由卵巢、侧输卵管、中输卵管、受精囊、附腺、前生殖腔(包含布氏交配囊、桑葚腺、生殖腔片)、后生殖腔(阴道和产卵针)组成.雄虫内生殖系统主要由精巢、精泵、输精管、附腺、输入射精管、输出射精管、后附腺和阳茎组成.其雌虫有泄殖腔,位于产卵针前端稍后,雄虫无泄殖腔.雌虫前生殖腔表面被2对肌肉包裹,内部的布氏交配囊、桑葚腺和生殖腔片不易被观察.精泵是一个淡黄色球体,由射精突(精泵内骨骼)、肌纤维(肌肉)、射精囊组成.柑橘大实蝇的内生殖形系统形态结构或组织经过进化,从而适应其伪产卵器的运动、交配、产卵等行为机制.为理解昆虫繁殖生理、进化和多样性,以及昆虫的产卵、交配和代谢物排泄等行为机制提供理论基础.

射精球蛋白EBP主要由射精管释放,是果蝇精液的重要组成部分.但是,EBP的具体作用机制及其在果蝇其它生命活动中的功能仍不清楚.本文检测了果蝇Ebp和EbpⅡ基因在不同发育阶段以及成虫精巢与卵巢中的表达水平.结果发现,Ebp和EbpⅡ基因在成虫中的表达水平显著高于其它发育阶段的果蝇,且它们在精巢中的表达显著高于卵巢.生物信息学分析表明,EBP和EBPⅡ蛋白仅包含若干低复杂区域,不含特殊的结构域,且它们的理化性质存在差异.在精细胞中特异性敲降Ebp后,果蝇储精囊中缺乏成熟的精子,但敲降EbpⅡ后精巢没有显著的表型变化.TUNEL实验结果显示,在精细胞和生殖干细胞中特异性敲降Ebp的表达均能引起精子束的异常凋亡.由此,推测Ebp基因参与果蝇精子发生过程,并在维持精细胞存活过程中起关键作用.

从蝗虫精母细胞装片制备过程中遇到的问题切入,分别解释了染色体着色的原理和卡诺氏液的作用、使用说明,分析了固定以后梯度置换出部分乙酸的原因以及精巢小管不需要解离的原因.