目的:运用均相时间分辨荧光(HTRF)检测方法,建立快速、稳定、高通量的抗炎药物细胞筛选模型,研究红豆杉中抗气道炎症有效活性成分.方法:采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)诱导支气管上皮细胞(HBE)建立炎症细胞模型,HTRF法检测细胞中Total 核转录因子-κB(NF-κB)及Phospho NF-κB表达情况.通过考察不同细胞密度(10、25、50k/孔)、刺激时间(5、10、20、30、60、120、240min)及刺激浓度对NF-κB磷酸化的影响,筛选出最佳气道炎症细胞模型.同时给予红豆杉不同提取物孵育后,观察其对NF-κB磷酸化的影响.结果:TNF-α及IL-1β均能够诱导HBE中NF-κB发生明显磷酸化,其中TNF-α EC50为0.41ng/mL,IL-1β EC50为5.69ng/mL;当细胞密度在10～25k/孔,刺激时间在5～30min时,磷酸化水平较高.红豆杉紫杉烷类及挥发油类成分能够降低细胞中NF-κB磷酸化水平.结论:成功建立了快速、稳定、高通量的抗气道炎症药物细胞筛选模型,红豆杉紫杉烷类及挥发油类成分有明显的抗气道炎症作用,具有较好的开发价值和应用前景.

通过分析全球中药提取物专利数据,揭示中药提取物研究的发展情况和创新趋势,为行业发展提供参考.基于Innography平台,对中药提取物全球专利进行检索和统计分析,从专利权人分布、地区分布、技术热点主题,专利强度以及专利侵权风险等角度进行深入解读,并以红豆杉为例进行了专利文本聚类分析.全球中药提取物研究总体呈上升趋势,专利申请主要集中在中国、日本、韩国和美国.美国企业综合实力最强,高价值专利量最多,在红豆杉提取物技术中处于优势地位.近年来美国专利诉讼量有所下降,大部分诉讼原告是科技型中小企业.文本聚类结果显示红豆杉提取物涉及了化学合成技术.近几年我国中药提取物专利申请量飞速增长,但申请人分布比较分散,高质量专利的申请量明显弱于美国、日本等国家.国内企业要充分利用现代科学手段不断挖掘中药新的有效成分和提取新工艺,从根本上提高中药提取物行业的竞争力.

为丰富产紫杉醇植物内生真菌资源库,从曼地亚红豆杉Taxus media茎中分离得到一株产紫杉醇的内生真菌TMS-26.通过对TMS-26的发酵提取物进行高效液相色谱分析,发现其具有与紫杉醇标准品(4.545 min)相近的色谱特征峰.进一步通过液质联用仪检测发现,内生真菌TMS-26的发酵提取物中具有与紫杉醇标准品((M+Na)+=876)相近的质谱特征峰,表明内生真菌TMS-26能够产生紫杉醇.同时通过传统形态学分类鉴定方法和18S rDNA序列分析、Internal-transcribed spacer (ITS)序列分析等现代分子生物学分类鉴定方法,最终将内生真菌TMS-26鉴定为曲霉属烟曲霉Aspergillus fumigatus,并命名为“烟曲霉TMS-26”.

目的 研究曼地亚红豆杉Taxus media枝叶的化学成分.方法 通过硅胶、凝胶Sephadex LH-20、ODS等色谱方法分离纯化,运用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等多种波谱技术鉴定化合物结构.结果 从曼地亚红豆杉乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯萃取部位分离鉴定出18个化合物,包括8个紫杉烷二萜类化合物:taxinine-11,12-oxide(1)、9α,10β-二乙酰基-2α-羟基-5α-桂皮酰基-3,11-环化紫杉烷-4(20)-烯-13-酮(2)、2-去乙酰氧基紫杉宁E(3)、7,9-二去乙酰基紫杉宁B(4)、紫杉吉酚(5)、9-去乙酰基紫杉宁A(6)、9-去乙酰基紫杉宁(7)、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (8);5个黄酮类化合物:山柰酚(9)、香橙素(10)、芹菜素(11)、金松双黄酮(12)、银杏双黄酮(13);3个酚酸类化合物:对羟基苯甲醛(14)、对羟基苯甲酸(15)、邻苯二酚(16);以及β-谷甾醇(17)、正二十烷-10-醇(18).结论 化合物18为首次从红豆杉科植物中发现,化合物1～4、6、7、10、14～16为首次从曼地亚红豆杉中分离得到.

利用广泛靶向代谢组的方法对相同生境下南方红豆杉野生种(Taxus wallichiana var.mairei)及栽培品种‘金锡杉’(Taxus wallichiana var.mairei cv.‘Jinxishan’)针叶中代谢物含量差异进行分析.结果 表明:(1)在野生种和栽培品种的针叶提取物中,共鉴定出689种代谢物并获得其相应的积分定量值,包括初生代谢物326种、次生代谢物334种和其他类成分29种.(2)定量分析结果显示,有71种代谢物在两种红豆杉中的表达差异显著,这些差异代谢物主要富集在糖代谢、脂质合成等初生代谢途径,以及黄酮类合成等次生代谢途径中.(3)在‘金锡杉’针叶中,大多数氨基酸(5种)和黄酮类代谢物(10种)含量远高于野生种,而糖代谢(3种)、脂类合成(4种)及TCA循环(3种)途径中的差异代谢物含量均远低于野生种.研究认为‘金锡杉’针叶中黄酮类次生代谢物含量升高归因于苯丙氨酸和酪氨酸代谢途径的协同调控,从而增强‘金锡杉’对外界环境的适应性;而‘金锡杉’中低含量的,涉及糖代谢、脂类生物合成以及TCA循环等途径的代谢物造成的能量供应不足,则通过合成大量的氨基酸类物质来维持平衡.

目的 观察红豆杉提取物灌胃给药对吸烟致慢性阻塞性肺病(COPD)模型小鼠的影响,对其药效进行评价,并对其作用机制进行初步探讨.方法 C57BL/6小鼠烟熏3个月后,收集肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,对BALF进行白细胞分类计数,取肺组织做组织切片进行HE染色和AB/PAS染色,观察炎症细胞浸润情况,并对超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、髓过氧化物酶(MPO)活性和TNF-α、KC、MIP-2表达量进行测定.结果 红豆杉提取物具有降低白细胞总数的作用,可显著增加SOD、GSH含量,抑制MPO活性,且具有显著抑制TNF-α、KC炎症因子的作用.结论 红豆杉提取物对COPD动物模型有一定的治疗效果,其作用机制可能与抑制中性粒细胞迁移、抑制炎症细胞因子的产生、抑制黏液分泌有一定关系.

目的:建立一种新型的药物活性成分筛选方法,用于筛选红豆杉抗肿瘤活性成分群.方法:在细胞正常代谢的基础上,对不同时间段、不同细胞模型的细胞上清液进行液相微萃取处理,对其中的活性成分群进行有效检测,根据色谱峰变化发现潜在活性成分群.将MCF-7、A549细胞作为活性筛选的平台,在细胞自然吸收状态下,以红豆杉提取物为研究对象,对中药材中的活性成分群进行筛选和捕获,而后进行HPLC分析.结果:成功筛选出红豆杉中的抗肿瘤活性成分群分别是脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、金松双黄酮、云南紫杉烷.结论:本研究试图为活性成分的筛选、中药质量的综合评价提供一种方便、普适和高效的新方法,为中药药效物质基础研究提供理论基础和实验依据.

目的 探讨南方红豆杉提取物对人前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT法检测不同浓度(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.5、3、6μg/μL)南方红豆杉提取物对人前列腺癌细胞株DU145和PC-3增殖的抑制作用,分别计算IC50.使用南方红豆杉提取物0、1.5 μg/μL分别处理PC-3和DU145细胞,并于第1?7天收集细胞进行存活细胞计数.检测不同浓度(0、1、2、3 μg/μL)南方红豆杉提取物对PC-3细胞凋亡及周期的影响.结果 不同浓度南方红豆杉提取物对DU145和PC-3细胞均有抑制作用(P＜0.05),且随着药物浓度的增加,其抑制作用逐渐增强.PC-3细胞的IC50为2.39 μg/μL,DU145细胞的IC50为3.84μg/μL.南方红豆杉提取物1.5μg/μL对PC-3和DU145细胞均有抑制作用,并且随着作用时间的延长,抑制作用逐渐增强.与南方红豆杉提取物0μg/μL相比,南方红豆杉提取物2、3μg/μL处理PC-3细胞处于早期凋亡与晚期凋亡的数量和G1期细胞比例逐渐增加(P＜0.05).结论 南方红豆杉提取物能抑制人前列腺癌细胞增殖,使肿瘤细胞周期出现G1期阻滞,促进其凋亡.