采用大孔吸附树脂、硅胶、ODS、Sephadex LH-20和HPLC等多种技术对山茱萸化学成分进行分离纯化,综合利用HR-ESI-MS、1D和2D NMR等波谱技术鉴定化合物结构,从山茱萸水提物中分离鉴定了 10个化合物,分别为(±)-cornuscone(1)、(-)-(Z)-4-hydroxy-3-methoxyphenylpropene 4-O-β-L-xylopyranosyl-(1 →6)-β-D-glucopyranoside(2)、kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside(3)、kampferol(4)、myricetin(5)、trifolin(6)、quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside(7)、quercetin 3-O-β-D-glucuronide-6"-methyl ester(8)、quercetin 3-O-β-D-glucuronide-6"-ethyl ester(9)、pyrogallol(10).化合物 1 为新的裂环环烯醚萜类化合物,命名为(±)-cornuscone,其结构中具有少见的C-1位甲基取代.选用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠RAW264.7细胞模型以评价化合物的抗炎活性,结果显示化合物1的半数抑制浓度(IC50)为(31.15±1.29)μmol·L-1,表明其抗炎活性显著优于阳性药吲哚美辛[indomethacin,IC50 为(48.32±1.66)μmol·L-1].

目的 为复方藤芷膏开发新剂型,并考察其透皮主要成分.方法 以凝胶贴膏剂基质的感官评价、初黏力、持黏力为综合指标,以NP-700、甘羟铝、EDTA-2Na、甘油、PVPK-90、酒石酸、纯化水的使用量作为课题的主要考察因素.依次采用单因素设计实验法和正交设计实验法在不同材料用量配比下优选凝胶贴膏剂的最佳基质配方.基于超高效液相色谱-电喷雾离子源-四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS),采用垂直Franz扩散池法进行透皮实验,检测复方藤芷凝胶贴膏剂的透皮主要成分并确定.结果 复方藤芷凝胶贴膏剂的最佳配方为NP-700 4.0 g,甘羟铝 0.5 g,EDTA-2Na 0.2 g,二氧化钛 2.0 g,甘油 40 g,PVPK-90 5.0 g,酒石酸 0.7 g,纯化水50 g,载药含量10%.透皮结果初步鉴定出3个化合物,包括大黄素、盐酸小檗碱及欧前胡素.结论 研究所得复方藤芷凝胶贴膏剂膏体均匀,表面光滑,易于涂布.成型后具有优良的初始黏力和保持黏力,易剥离,无残留,保湿性好,对皮肤无刺激性和致敏性.透皮成分的确定为寻找其药效物质基础及进一步建立全面的质量控制方法提供了依据.

外泌体是由活细胞主动分泌的一种纳米级囊泡，内含蛋白质、核酸等生物活性物质，参与细胞间通讯，在肿瘤微环境调节、免疫识别、炎症反应等众多生理病理过程中发挥重要作用。作为一种运输载体，外泌体广泛存在于生物流体中，但由于其粒径小、内含物丰度低，能否获得高质量的外泌体成为后续研究成败的关键。虽然外泌体分离、纯化和鉴定方法日趋发展，但仍未达到成熟水平。本文就外泌体分离和纯化方法的研究进行综述，并比较不同方法的优缺点、适用范围及应用前景，以期为外泌体研究提供参考。

目的:探讨不同生产工艺对人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)可能存在的致敏反应的影响。方法:在4种不同生产工艺人用狂犬病疫苗免疫后的临床血清中随机选取360份血清样本，ELISA法检测不同生产工艺疫苗和不同采血时间点血清样本中的总IgE水平，采用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果:总IgE检测结果显示，4种疫苗免疫后的血清总IgE阳性率均为20% (6/30)，总IgE的均值最低为9 IU/ml，最高为210 IU/ml，重复测量的方差分析显示不同时间采血检测的总IgE水平差异无统计学意义( P＝0.284)，多步浓缩纯化的人二倍体细胞疫苗的总IgE水平明显低于Vero细胞疫苗( P＝0.024)。 结论:免疫剂量的增加不会导致总IgE水平的升高，人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)的生产工艺能够对可能的致敏性杂质进行去除，具有良好的安全性。

目的:利用超声靶向微泡破裂(UTMD)技术介导T细胞Itch基因沉默，观察T细胞免疫活性变化。方法:磁珠分选纯化T细胞，构建靶向Itch基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒。实验组为超声辐照＋Itch-shRNA质粒-SonoVue微泡，对照组为超声辐照＋阴性对照shRNA质粒-SonoVue微泡，空白组未处理。转染48 h，荧光显微镜和流式细胞术评估细胞转染效率，免疫印迹(Western blot)法检测Itch基因蛋白表达水平。转染72 h,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞上清液中白介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)水平。采用单因素方差分析比较多组间差异，两两比较LSD- t检验。 结果:利用UTMD技术介导shRNA转染效率达到52.3%，转染后实验组、对照组和空白组Itch相对蛋白表达量分别为0.301±0.080、0.773±0.101和0.719±0.090，实验组Itch蛋白表达显著降低，差异有统计学意义( F＝24.441， P<0.01)。转染72 h，实验组、对照组和空白组IL-2浓度分别为(417.3±37.1)ng/L、(158.7±17.3)ng/L和(147.0±10.2)ng/L，差异有统计学意义( F＝118.701， P<0.001)；IFN-γ浓度分别为(168.3±12.1)ng/L、(74.3±3.7)ng/L和(74.6±7.1)ng/L，差异有统计学意义( F＝126.833， P<0.001)；实验组IL-2和IFN-γ表达水平较对照组和空白组显著升高。 结论:利用UTMD技术介导Itch-shRNA转染能明显降低T细胞Itch水平，增强T细胞免疫活性。

目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:观察重症肌无力（MG）患者白细胞介素（IL）-36的表达，研究IL-36对MG患者调节性T细胞（Tregs）和Th17细胞的调控作用。方法:入组2016年7月至2021年8月新乡市中心医院就诊的MG患者51例（MG组）和健康对照者25名（对照组），采集外周血，分离血浆和外周血单个核细胞（PBMCs），采用酶联免疫吸附试验检测血浆IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36RA、IL-35、IL-17水平，流式细胞术检测Tregs和Th17细胞比例，实时定量聚合酶链反应法检测叉头盒蛋白3（FoxP3）和维甲酸相关孤独核受体γt（RORγt）mRNA表达。用重组IL-36β（5 ng/ml）刺激MG患者的PBMCs或纯化的Tregs，分析Tregs和Th17细胞比例、IL-35和IL-17分泌、FoxP3和RORγt mRNA表达、Tregs抑制活性的变化。结果:IL-36α、IL-36γ、IL-36RA水平在对照组和MG组之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。MG组IL-36β水平高于对照组［（73.43±13.91）pg/ml比（60.91±12.65）pg/ml， t=3.79， P<0.001）。MG组Tregs比例［（4.67±1.33）%比（6.32±1.81）%， t=4.48， P<0.001］、IL-35水平［（50.06±7.93）pg/ml比（65.37±8.90）pg/ml， t=7.59， P<0.001］、FoxP3 mRNA（1.03±0.14比1.57±0.46， t=7.78， P<0.001）低于对照组，而Th17细胞比例［（1.05±0.15）%比（0.94±0.21）%， t=2.61， P=0.011］、IL-17水平［（40.61±13.13）pg/ml比（33.09±11.48）pg/ml， t=2.44， P=0.017］、RORγt mRNA（1.26±0.16比1.03±0.13， t=6.08， P<0.001）高于对照组（均 P<0.05）。上述指标在不同性别之间、早发型和晚发型之间、非胸腺瘤组和胸腺瘤组之间、不同Osserman分型之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05），与定量重症肌无力（QMG）量表评分均无明显相关性（均 P>0.05）。重组IL-36β对MG患者PBMCs增殖无影响（ P=0.248），可降低Tregs比例［（3.05±0.66）%比（4.18±1.07）%， t=4.23， P<0.001］、IL-35分泌［（48.12±10.93）pg/ml比（56.96±13.73）pg/ml， t=2.36， P=0.023］和FoxP3 mRNA表达（0.99±0.17比1.18±0.13， t=4.01， P<0.001），但对Th17细胞比例、IL-17分泌和RORγt mRNA表达无影响（均 P>0.05）。重组IL-36β刺激的Tregs免疫抑制活性减弱，表现为细胞增殖升高［（0.83±0.12）×10 5个比（0.69±0.15）×10 5个， t=3.02， P=0.005］和IL-35分泌降低［（28.71±10.08）pg/ml比（37.12±10.47）pg/ml， t=2.39， P=0.023］。 结论:MG患者中升高表达的IL-36β可能主要通过抑制Tregs功能调控Tregs/Th17细胞平衡。

目的:比较正常生育男性及少弱精子症患者 DAZL基因启动子区域DNA甲基化水平的差异。 方法:采用病例对照研究，回顾性分析2018年6月至2019年6月期间于徐州医科大学附属连云港医院就诊的具有正常生育男性（对照组）15例和少弱精子症患者35例（少弱精子症组）的临床资料，对精液标本进行精子形态与精子浓度、活力分析。提取精液基因组DNA行亚硫酸氢盐处理，利用PCR体外扩增并将PCR产物经纯化后与pCR2.1载体连接及酶切验证，挑选阳性克隆进行测序和DNA甲基化程度差异比较。结果:对照组 DAZL基因启动子均呈低甲基化水平，甲基化率为0.96%±0.46%，少弱精子症组甲基化率为12.15%±11.35%，组间差异有统计学意义（ P=0.000 4）； DAZL基因甲基化率在少弱精子症组患者中个体差异明显，有12例（34.3%）患者DNA甲基化水平超过10%。 结论:DAZL基因启动子区域甲基化异常可能和少弱精子症有关，有望成为男性生精缺陷的生物学标志之一。

目的:观察慢性心衰患者中T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白-3（TIM-3）的表达及其对T细胞的调控作用。方法:收集2018年1至10月在郑州大学第一附属医院心血管内科住院治疗的慢性心衰患者86例（心衰组）和在郑州大学第一附属医院接受查体的健康对照32名（健康对照组），分离外周血单个核细胞，流式细胞术检测CD4 +T细胞和CD8 +T细胞中TIM-3的表达。分选CD4 + T细胞和CD8 +T细胞，使用抗TIM-3抗体刺激培养。酶联免疫吸附试验检测CD4 +T细胞培养上清中干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-35、IL-17、IL-22水平和CD8 +T细胞培养上清中肿瘤坏死因子（TNF-α）和IFN-γ水平，实时定量PCR法检测CD4 +T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、FoxP3、RORγt和CD8 +T细胞中穿孔素、颗粒酶B mRNA相对表达量。组间比较采用 t检验或配对 t检验进行。 结果:心衰组TIM-3 +CD4 +T细胞比例高于健康对照组（3.47%±1.06%比0.92%±0.27%， P<0.001），心衰组TIM-3 +CD8 +T细胞比例亦高于健康对照组（6.12%±1.91%比1.77%±0.63%， P<0.001）。慢性心衰患者存在CD4 +T细胞和CD8 +T细胞功能不全，表现为心衰组CD4 +T细胞分泌IFN-γ、IL-17和IL-22水平低于健康对照组，分泌IL-10和IL-35水平高于健康对照组（均 P<0.05）。心衰组CD4 +T细胞中T-bet和RORγt mRNA相对表达量低于健康对照组（均 P<0.01），FoxP3 mRNA相对表达量高于健康对照组（1.93±0.88比0.97±0.28， P=0.031）。心衰组CD8 +T细胞分泌TNF-α和IFN-γ水平低于健康对照组（均 P<0.05），穿孔素和颗粒酶B mRNA相对表达量亦低于健康对照组（均 P<0.05）。抗TIM-3抗体刺激慢性心衰患者纯化的CD4 +T细胞，分泌IFN-γ、IL-17和IL-22水平高于无抗TIM-3抗体刺激（均 P<0.05），分泌IL-35水平则低于无抗TIM-3抗体刺激[（61±13）ng/ml比（72±17）ng/ml， P=0.029]。抗TIM-3抗体刺激后CD4 +T细胞中T-bet和RORγt mRNA相对表达量高于无TIM-3抗体刺激（均 P<0.05）。抗TIM-3抗体刺激慢性心衰患者纯化的CD8 +T细胞后，分泌TNF-α和IFN-γ水平高于无抗TIM-3抗体刺激（均 P<0.01），穿孔素和颗粒酶B mRNA相对表达量亦高于无抗TIM-3抗体刺激（均 P<0.05）。 结论:慢性心衰患者中T细胞表面TIM-3升高表达，TIM-3可能参与了慢性心衰患者T细胞功能不全的调控。

目的:初步探讨血清外泌体长链非编码RNA（lncRNA）对卵巢上皮性癌（卵巢癌）的诊断价值。方法:（1）收集2018年8月至2019年12月在广西医科大学附属肿瘤医院住院治疗的卵巢肿瘤患者，包括卵巢癌35例（恶性组）和卵巢良性肿瘤20例（良性组）；收集同期在本院体检的健康妇女15例（正常组）作为对照。抽取3组妇女的外周静脉血，采用商品试剂盒分离、纯化血清外泌体；外泌体的鉴定：透射电子显微镜观察外泌体的形态，NanoSight纳米颗粒分析技术分析外泌体的粒径分布，蛋白印迹（western blot）法检测外泌体的特异性标志蛋白分化群（CD） 63、CD 81、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）的表达情况。（2）随机抽取恶性组中4例卵巢癌患者（恶性测序组）和正常组中3例健康妇女（正常测序组），采用高通量测序技术分析两组妇女的血清外泌体差异表达的lncRNA，并筛选出差异表达明显的lncRNA；实时荧光定量PCR技术验证筛选出的差异表达lncRNA在恶性测序组和正常测序组妇女血清中的表达，进一步扩大样本量（即恶性组、良性组、正常组共70份血清）验证筛选出的差异表达lncRNA在其中的表达。（3）绘制筛选出的差异表达lncRNA诊断卵巢癌的受试者工作特征（ROC）曲线，评价其敏感度和特异度等诊断效能；构建多因子联合诊断模型，通过logistic回归模型结合ROC曲线，评价其对卵巢癌发生的诊断效能。 结果:（1）透射电子显微镜观察，血清外泌体为脂质双层膜结构，一侧呈凹陷的半球形或杯托样；NanoSight纳米颗粒分析技术分析显示，外泌体颗粒的直径峰值为127.6 nm，直径30~150 nm的外泌体颗粒占58.9%；western blot法检测显示，与卵巢癌细胞系SKOV3细胞相比，血清外泌体的特异性标志蛋白CD 63、CD 81、TSG101蛋白的表达强度明显增强。（2）高通量测序技术分析显示，相对于正常测序组妇女，恶性测序组患者血清外泌体中筛选出差异表达lncRNA 425个（其中上调23个、下调402个）；挑选上调、下调表达异常明显的lncRNA 6个，即FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811、CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428，采用实时荧光定量PCR技术对恶性测序组和正常测序组妇女血清进行验证，其表达情况与测序结果一致。随后对这6个lncRNA进一步扩大样本量验证，恶性组患者血清外泌体中FER1L6-AS2、LINC00470、LINC01811的表达水平分别升高至良性组、正常组妇女的1.66、1.84倍，2.05、2.46倍，2.94、2.35倍，CXXC4-AS1、LINC02343、LINC02428的表达水平分别下降至良性组、正常组妇女的29%、34%，40%、46%，42%、42%，同一lncRNA的表达水平在恶性组与良性组、恶性组与正常组中分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05），而良性组与正常组分别比较，差异均无统计学意义（ P均>0.05）。（3）6个差异表达lncRNA单独诊断卵巢癌的ROC曲线下面积（AUC）为0.722~0.805，具有中等诊断价值。联合因子预测模型1（包括FER1L6-AS2和LINC01811）、联合因子预测模型2（包括CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）、联合因子预测模型3（包括FER1L6-AS2、CXXC4-AS1、LINC02343和LINC02428）的AUC分别为0.865、0.934和0.962，各联合因子预测模型的诊断效能均显著高于单一lncRNA的诊断效能（ P均<0.05）。 结论:经实时荧光定量PCR技术验证，高通量测序技术是筛选血清外泌体差异表达lncRNA的有效方法；血清外泌体多个lncRNA联合检测对卵巢癌患者的诊断效能显著高于单一lncRNA检测。检测血清外泌体lncRNA可为卵巢癌的诊断提供新的思路。