目的:评价Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)/受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)信号通路在脂多糖(LPS)-三磷酸腺苷(ATP)致小鼠巨噬细胞焦亡中的作用。方法:常规培养小鼠RAW264.7巨噬细胞，采用随机数字表法分为6组( n＝9)：空白对照组(C组)、LPS-ATP组、LPS-ATP＋转染阴性对照scRNA组(LPS-ATP＋scRNA组)、LPS-ATP＋ZBP1小干扰RNA组(LPS-ATP＋siRNA组)、LPS-ATP＋二甲基亚砜组(LPS-ATP＋DMSO组)和LPS-ATP＋RIPK1抑制剂nec-1组(LPS-ATP＋nec-1组)。LPS-ATP＋siRNA组使用siRNA技术抑制ZBP1的表达，LPS-ATP＋nec-1组给予nec-1抑制RIPK1的表达；C组常规培养，余5组给予10 μg/ml LPS孵育24 h，然后加入5 mmol/L ATP孵育30 min构建细胞焦亡模型。采用CCK-8法检测细胞存活情况；ELISA法检测细胞上清液IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α浓度；碘化丙啶荧光染色法测定细胞焦亡情况；Western blot法检测ZBP1、RIPK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)和消皮素D(GSDMD)表达。 结果:与C组比较，LPS-ATP组细胞存活率降低，细胞焦亡率升高，上清液IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α浓度升高，细胞ZBP1、RIPK1、caspase-1和GSDMD表达上调( P<0.05)；与LPS-ATP组比较，LPS-ATP＋scRNA组和LPS-ATP＋DSMO组上述各指标差异无统计学意义( P>0.05)；与LPS-ATP＋scRNA组比较，LPS-ATP＋siRNA组细胞存活率升高，细胞焦亡率降低，上清液IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α浓度降低，细胞ZBP1、RIPK1、caspase-1和GSDMD表达下调( P<0.05)；与LPS-ATP＋DSMO组比较，LPS-ATP＋nec-1组细胞存活率升高，细胞焦亡率降低，上清液IL-1β、IL-6、IL-18及TNF-α浓度降低，RIPK1、caspase-1和GSDMD表达下调( P<0.05)，ZBP1表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:ZBP1/RIPK1信号通路激活参与了LPS-ATP致小鼠巨噬细胞焦亡的过程。

目的:评价二甲双胍预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤时单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/PTEN诱导假定激酶1(PINK1)信号通路的影响。方法:清洁级健康雄性SD大鼠36只，6周龄，体质量120~160 g，采用随机数字表法分为3组( n＝12)：糖尿病假手术组(DS组)、糖尿病心肌缺血再灌注组(DI/R组)和糖尿病心肌缺血再灌注+二甲双胍预处理组(DI/R+Met组)。高脂高糖饲料喂养4周后，通过单次腹腔注射1%链脲佐菌素40 mg/kg制备2型糖尿病模型。采用阻断左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。DI/R+ Met组于心肌缺血前1周给予每天1次二甲双胍200 mg/kg灌胃处理。于再灌注120 min时采集股静脉血样，采用ELISA法检测血清CK-MB和cTnI浓度；随后处死大鼠取心肌组织，采用HE染色法观察病理学结果；采用伊文氏蓝和TTC双重染色法确定心肌梗死体积百分比；采用Western blot法检测心肌自噬相关蛋白Beclin-1、PINK1、磷酸化AMPK(p-AMPK)的表达和微管相关蛋白1轻链3 Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)的比值。 结果:与DS组比较，DI/R组和DI/R+ Met组心肌梗死体积百分比、血清CK-MB和cTnI浓度升高，心肌Beclin-1、p-AMPK和PINK1表达上调，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高( P<0.05)，病理学损伤加重；与DI/R组比较，DI/R+ Met组心肌梗死体积百分比、血清CK-MB和cTnI浓度降低，心肌Beclin-1、p-AMPK和PINK1表达上调，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高( P<0.05)，病理学损伤减轻。 结论:二甲双胍预处理减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制与激活AMPK/PINK1信号通路上调线粒体自噬水平有关。

本文于2020年4月22日优先发布于中华眼科杂志官网目的:探讨眼部组织新型冠状病毒侵染和激活关键蛋白人血管紧张素转换酶2（ACE2）和跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的情况，明确新型冠状病毒在眼部的侵染基础。方法:实验研究。选取30只小鼠，按性别、年龄、是否诱导糖尿病模型分为雄性组、雌性组、老年组、糖尿病组及糖尿病对照组，每组6只。使用荧光定量PCR分析小鼠结膜、角膜、泪腺、虹膜、晶状体、视网膜ACE2基因和TMPRSS2基因表达情况，并与肺脏、心脏、肾脏、肝脏中两个基因的表达量进行比较。使用免疫组化染色分析了小鼠各组织中ACE2和TMPRSS2蛋白的分布和表达情况。另取山东省眼科研究所红十字眼库接收的符合捐献条件的志愿者角膜及结膜组织切片，与小鼠眼部ACE2蛋白和TMPRSS2蛋白表达进行验证比较。同时通过分析已发表的人眼部组织转录组数据库，比较人角膜和结膜中ACE2和TMPRSS2基因的表达情况。对不同性别、年龄、及糖尿病条件下小鼠眼表组织的ACE2基因表达变化进行分析，采用独立样本 t检验对数据进行统计学分析。对数据库中人角膜和结膜组织两种基因表达分析，采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析。 结果:在小鼠6种眼部组织中，结膜ACE2基因和TMPRSS2基因表达量最高，但均低于肾脏和肺脏；ACE2和TMPRSS2蛋白阳性染色集中于结膜上皮、角膜上皮和泪腺腺泡。ACE2基因的表达具有性别差异，在雌性小鼠结膜和角膜的表达显著低于雄性小鼠，分别为雄性相应组织的43% （ t=3.269， P=0.031）和63% （ t=4.080， P=0.015）；糖尿病小鼠结膜和泪腺中的ACE2基因表达略高于非糖尿病小鼠，分别为1.21倍和1.10倍 （ P>0.05）；不同年龄小鼠ACE2基因表达差异无统计学意义。与小鼠相似，人结膜ACE2和TMPRSS2基因表达量显著高于角膜（ P=0.007），分别约为角膜上皮基因表达量的5.74倍和12.84倍。 结论:结膜中ACE2和TMPRSS2的表达在6种检测的眼部组织中最高，提示结膜是新型冠状病毒眼部感染的主要靶组织。 （中华眼科杂志，2020，56：438-446）

目的:探讨法舒地尔对主动脉平滑肌细胞（VSMC）自噬及凋亡的影响以及与磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的关系。方法:用10%胎牛血清+DMEM培养液培养SD大鼠VSMC，并利用免疫细胞化学染色法检测传代细胞α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的表达情况鉴定VSMC。采用血小板源性生长因子（PDGF）诱导VSMC，并将PDGF诱导的VSMC分为空白组、对照组、法舒地尔组（30 μmol/L法舒地尔）、法舒地尔+LY294002组（30 μmol/L法舒地尔+25 μmol/L LY294002）。采用MTT法检测各组细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞凋亡率和凋亡周期，GFP-mRFP-LC3双荧光检测细胞自噬水平。采用蛋白免疫印迹法（WB）检测各组细胞Bax、Bcl-2、LC3、Beclin-1及PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表达情况并比较分析。结果:镜下观察培养细胞呈长梭形、放射性生长，出现典型的"峰-谷"样结构，a-SMA阳性表达率为99%，确认所培养细胞为高纯度主动脉VSMC。法舒地尔组细胞增殖能力低于对照组（ P<0.05），法舒地尔+LY294002组高于法舒地尔组（ P<0.05）。与对照组比较，法舒地尔组凋亡率及G 0-G 1期细胞比例升高（均 P<0.05）；与法舒地尔组相比，法舒地尔+LY294002组凋亡率及G 0-G 1期细胞比例回降（均 P<0.05）。与对照组比较，法舒地尔组自噬增强（ P<0.05），而法舒地尔+LY294002组的自噬则较法舒地尔组有所减弱（ P<0.05）。与对照组比较，Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1水平以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平升高（均 P<0.05）；法舒地尔+LY294002组Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin 1水平以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平较法舒地尔组有所回降（均 P<0.05）。 结论:法舒地尔通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制VSMC增殖，促进自噬及凋亡，改善血管功能。

目的:评价脊髓哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)/Gli1信号通路在小鼠慢性吗啡耐受中的作用。方法:健康雄性昆明小鼠，8～10周龄，体重23～25 g。实验Ⅰ　取小鼠50只，采用随机数字表法分为2组：生理盐水组(S组， n＝10)和吗啡组(M组， n＝40)。M组和S组分别皮下注射吗啡和生理盐水10 mg/kg，2次/d，连续7 d。于给药前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈，计算最大镇痛效应百分比(MPE)。M组于给药后1、3、5和7 d热痛阈测定结束后、S组于最后1次热痛阈测定结束后随机处死10只小鼠，取脊髓组织。实验Ⅱ　取小鼠40只，采用随机数字表法分为4组( n＝10)：KU-0063794+吗啡组(KU+M组)、二甲基亚砜(DMSO)+吗啡组(DM+M组)、吗啡+KU-0063794组(M+KU组)和吗啡+二甲基亚砜组(M+DM组)。4组皮下注射吗啡10 mg/kg，2次/d，连续7 d。于第1～3天每天吗啡注射前30 min时，KU+M组腹腔注射mTOR特异性抑制剂KU-0063794 200 μl(1 μg/μl)，DM+M组腹腔注射10%DMSO 200 μl，2次/d；于第5～7天每天吗啡注射前30 min时，M+KU组腹腔注射KU-0063794 200 μl (1 μg/μl)，M+DM组腹腔注射10%DMSO 200 μl，2次/d。于吗啡注射前1 d和每天最后1次给药后30 min测定热痛阈，计算MPE。最后1次热痛阈测定结束后处死大鼠，取脊髓组织。采用Western blot法检测脊髓mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1和Gli1的表达水平。 结果:实验Ⅰ　与S组比较，M组给药后各时点MPE升高，给药后第3、5和7天时脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)。实验Ⅱ　与DM+M组比较，KU+M组注射吗啡后第3～7天时MPE降低，脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)；与M+DM组比较，M+KU组注射吗啡后第6和7天时MPE升高，脊髓p-mTOR、p-S6K1和Gli1表达下调( P<0.05)，mTOR和S6K1表达差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:脊髓mTOR/S6K1/Gli1信号通路参与了小鼠慢性吗啡耐受的形成和维持。

目的:评价一磷酸腺苷依赖的蛋白激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶/核因子E2相关因子2(AMPK/p38 MAPK/Nrf2)信号通路在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法:清洁级健康SD雄性大鼠，2~3月龄，体重220~280 g，高脂饲料喂养，腹腔注射1%链脲佐菌素50 mg/kg，连续4 d，制备糖尿病模型。取糖尿病模型制备成功的大鼠30只，按随机数字表法分为3组( n＝10)：假手术组(Sham组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)和AMPK抑制剂Compound C+心肌缺血再灌注组(C+I/R组)。采用结扎左冠状动脉前降支30 min、再灌注120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。C+I/R组于缺血前30 min时尾静脉注射Compound C 0.5 mg/kg，Sham组和I/R组尾静脉注射等量生理盐水。再灌注120 min时计算心肌梗死面积百分比，采用ELISA法测定血清CK-MB、LDH浓度，采用ELISA法测定心肌组织谷胱甘肽(GSH)、SOD、ROS水平，采用Western blot法测定心肌组织AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、Nrf2、血红素氧合酶1(HO-1)的表达。 结果:与Sham组比较，I/R组心肌梗死面积百分比、血清CK-MB、LDH水平升高，心肌组织GSH和SOD水平降低，ROS水平增加，AMPK、p-AMPK、p-p38 MAPK、Nrf2、HO-1表达上调( P<0.05)；与I/R组比较，C+I/R组心肌梗死面积百分比、血清CK-MB、LDH水平升高，心肌组织GSH和SOD水平降低，ROS水平增加，AMPK、Nrf2、HO-1表达下调( P<0.05)。 结论:AMPK/p38 MAPK/Nrf2信号通路参与了糖尿病大鼠心肌缺血再灌注时内源性抗氧化应激机制。

目的:评价预先注射青年大鼠血浆对老龄大鼠脑缺血再灌注后认知功能障碍的影响及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在其中的作用。方法:SPF级健康雄性老龄SD大鼠72只，18月龄，体质量600~650 g，采用随机数字表法分为4组( n＝18)：对照组(C组)、脑缺血再灌注组(IR组)、预先注射青年大鼠血浆组(P组)和PI3K抑制剂LY294002组(LY组)。P组和LY组尾静脉注射青年大鼠血浆100 μl/次，C组和IR组尾静脉注射等容量生理盐水，2次/周，持续4周。然后IR组、P组和LY组在七氟烷麻醉下建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型。麻醉前1 h时LY组尾静脉注射LY294002 0.3 mg/kg。再灌注后24 h时行神经功能缺损评分(Longa评分)，然后随机处死6只大鼠取脑组织，测定脑梗死体积。再灌注29 d时行旷场试验评估大鼠自发活动能力和焦虑样行为，再灌注30 d时行新物体识别实验评估大鼠认知功能。行为学测试结束后处死大鼠，分离海马组织，采用Western blot法测定磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、突触后致密蛋白-95(PSD-95)和突触囊泡蛋白(SYN)的表达，测量海马CA1区神经元树突长度和树突棘密度。 结果:4组大鼠运动速度、路程以及旷场中心停留时间比较差异无统计学意义( P>0.05)。与C组比较，IR组、P组和LY组Longa评分和脑梗死体积升高，新物体探索百分比和辨别指数降低，海马组织p-PI3K、p-Akt、PSD-95和SYN表达下调，海马神经元树突长度和树突棘密度降低( P<0.05)；与IR组比较，P组Longa评分和脑梗死体积降低，新物体探索百分比和辨别指数升高，海马组织p-PI3K、p-Akt、PSD-95和SYN表达上调，海马神经元树突长度和树突棘密度增加( P<0.05)，LY组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)；与P组比较，LY组Longa评分和脑梗死体积升高，新物体探索百分比和辨别指数降低，海马组织p-PI3K、p-Akt、PSD-95和SYN表达下调，海马神经元树突长度和树突棘密度降低( P<0.05)。 结论:预先注射青年大鼠血浆可减轻老龄大鼠脑缺血再灌注后认知功能障碍，其机制与激活海马PI3K/Akt信号通路，改善突触可塑性有关。

目的:探讨受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)介导的程序性坏死在糖尿病因素取消大鼠七氟烷后处理心肌保护效应中的作用。方法:取糖尿病造模成功的大鼠80只，4~5周龄，体重90~100 g，采用随机数字表法分为4组( n＝20)：假手术组(Sham组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、七氟烷后处理组(SP组)、七氟烷后处理+RIPK3抑制剂GSK-872组(GSK组)。采用结扎左冠状动脉前降支40 min，再灌注120 min的方法制备糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。SP组于再灌开始时吸入2.4%七氟烷15 min；GSK组于术前24、2 h时腹腔注射GSK-872 3.3 mg/kg(溶于生理盐水)，其他操作同SP组。再灌注120 min时，取腹主动脉血样，检测血清LDH和CK-MB浓度；取心肌组织，TTC染色法确定心肌梗死面积百分比，免疫组化法检测RIPK3的表达，Western blot法检测RIPK3、磷酸化钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)、磷酸化混合谱系激酶结构域样假激酶(p-MLKL)的表达水平，透射电镜观察心肌超微结构。 结果:与Sham组比较，I/R组血清LDH和CK-MB浓度、心肌梗死面积百分比升高，心肌组织RIPK3、p-MLKL和p-CaMKⅡ表达上调( P<0.05)，心肌细胞损伤严重。与I/R组比较，SP组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)。与SP组比较，GSK组血清LDH、CK-MB浓度和心肌梗死面积百分比降低，心肌组织RIPK3、p-MLKL和p-CaMKⅡ表达下调( P<0.05)，心肌细胞损伤程度减轻。 结论:糖尿病因素取消大鼠七氟烷后处理心肌保护效应的机制与其过度激活RIPK3介导的程序性坏死有关。

目的:评价磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在依达拉奉减轻老龄大鼠术后认知功能障碍中的作用。方法:健康雄性SD大鼠60只，20月龄，体质量600~700 g，采用随机数字表法分为4组( n＝15)：对照组(C组)、手术组(O组)、依达拉奉组(E组)和PI3K抑制剂LY294002组(LY组)。O组、E组和LY组于3%七氟烷麻醉下行剖腹探查术。E组和LY组术前30 min时腹腔注射依达拉奉3 mg/kg，同时LY组尾静脉注射LY294002 0.3 mg/kg。术后3 d时行旷场实验评估大鼠自发活动能力，然后行Morris水迷宫实验评估大鼠认知功能。行为学实验结束后处死大鼠分离海马组织，采用Western blot法测定磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、突触素(SYP)和突触后致密蛋白95(PSD-95)的表达水平，行高尔基染色记录海马CA1区神经元树突长度，计算树突棘密度。 结果:4组运动速度、路程及旷场中心停留时间比较差异无统计学意义( P>0.05)。与C组比较，O组逃避潜伏期延长，穿越原平台位置次数减少，海马p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、SYP和PSD-95表达下调，海马CA1区神经元树突长度缩短，树突棘密度降低( P<0.05)；与O组比较，E组逃避潜伏期缩短，穿越原平台位置次数增加，海马p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、SYP和PSD-95表达上调，海马CA1区神经元树突长度增加，树突棘密度升高( P<0.05)；与E组比较，LY组逃避潜伏期延长，穿越原平台位置次数减少，海马p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、SYP和PSD-95表达下调，海马CA1区神经元树突长度缩短，树突棘密度降低( P<0.05)。 结论:依达拉奉减轻老龄大鼠术后认知功能障碍的机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，改善海马突触可塑性有关。

目的:评价艾司氯胺酮对丙泊酚麻醉致发育期大鼠远期认知功能障碍的影响及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)信号通路在其中的作用。方法:清洁级健康SD大鼠48只，雌雄不拘，7日龄，体质量10~15 g，采用随机数字表法分为4组( n＝12)：脂肪乳剂组(C组)、丙泊酚组(P组)、艾司氯胺酮+丙泊酚组(EP组)和PI3K抑制剂LY294002+艾司氯胺酮+丙泊酚组(LYEP组)。C组腹腔注射中/长链脂肪乳注射液100 mg/kg；P组腹腔注射丙泊酚50 mg/kg，待大鼠翻正反射恢复后(40~60 min)，再追加丙泊酚50 mg/kg；EP组腹腔注射艾司氯胺酮10 mg/kg，随后再给予丙泊酚，方法同P组；LYEP组经侧脑室注射LY294002 25 μg，30 min后腹腔注射艾司氯胺酮10 mg/kg，随后给予丙泊酚，方法同P组。于苏醒后2 h时，每组随机处死6只大鼠，采用HE染色法检测海马神经元病理学结果，采用Western blot法检测海马组织Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、Bax和cleaved caspase-3的表达。剩余6只大鼠于出生后30 d时采用Y迷宫实验评估学习记忆能力。 结果:与C组比较，P组、EP组和LYEP组海马组织p-Akt/Akt比值降低，Bax和cleaved caspase-3表达上调，学会所需训练次数增加，正确反应率降低( P<0.05)，海马CA1区神经元发生病理学损伤；与P组比较，EP组和LYEP组海马组织p-Akt/Akt比值升高，Bax和cleaved caspase-3表达下调，学会所需训练次数减少，正确反应率升高( P<0.05)，海马CA1区神经元病理学损伤减轻；与EP组比较，LYEP组海马组织p-Akt/Akt比值降低，Bax和cleaved caspase-3表达上调，学会所需训练次数增加，正确反应率降低( P<0.05)，海马CA1区神经元病理学损伤加重。 结论:艾司氯胺酮可减轻丙泊酚致发育期大鼠远期认知功能障碍，其机制与激活PI3K/Akt信号通路，抑制神经元凋亡有关。