目的 探讨不同浓度美洲大蠊小肽预处理对H2O2诱导人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)氧化应激及凋亡的影响.方法 取对数生长期的KGN细胞,分为空白组、H2O2组和美洲大蠊小肽50、100、150组.各组均常规培养24 h,空白组不予特殊处理,H2O2组加入250 μmol/L H2O2作用6 h;美洲大蠊小肽50、100、150组分别加入50、100、150 μg/mL美洲大蠊小肽进行预处理,然后加入250 μmol/L H2O2作用6 h.采用CCK-8法检测空白组、H2O2组和美洲大蠊小肽50、100、150组分别预处理6、12、24 h的细胞存活率,并比较各组(美洲大蠊小肽50、100、150组均预处理12 h)细胞活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)表达.结果 H2O2组细胞存活率低于空白组(P＜0.05).预处理6 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率与H2O2组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05),预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率均高于H2O2组(P均＜0.05).与预处理6 h比较,美洲大蠊小肽50、100、150组预处理12、24 h的细胞存活率均升高(P均＜0.05);预处理12、24 h的美洲大蠊小肽50、100、150组细胞存活率比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).与空白组比较,H2O2组细胞MDA、NO、ROS表达均升高(P均＜0.05);与H2O2组比较,美洲大蠊小肽50、100、150组细胞MDA、NO、ROS表达均降低(P均＜0.05),美洲大蠊小肽50、100、150组间比较差异均无统计学意义(P均＞0.05).结论 美洲大蠊小肽预处理能够减轻H2O2诱导的KGN细胞氧化应激及凋亡,以50 μg/mL作用12 h为最佳预处理条件.

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目的 探索美洲大蠊精制物CⅡ3及相关合成短肽HFDT1在小鼠体内的抗肿瘤作用及其对免疫功能的影响.方法 取BALB/c小鼠60只,建立小鼠白血病细胞L1210荷瘤模型,随机分为5组,用美洲大蠊精制物CⅡ3高、低剂量及相关人工合成短肽HFDT1连续给药10 d,设环磷酰胺(CTX)为阳性对照,模型组给予生理盐水,另取BALB/c小鼠12只作为正常对照,评估受试药的肿瘤抑制作用及对小鼠体重的影响;然后取小鼠胸腺、脾脏、外周血,通过称重、血细胞自动分析、流式细胞术、双抗体夹心ELISA等方法分析胸腺及脾脏指数、外周血免疫细胞数量的变化、脾脏淋巴细胞及B细胞(CD45R+细胞)与T细胞(CD3+细胞)比例变化、T细胞亚群(CD3+ CD4+细胞与CD3+ CD8+细胞)的变化、小鼠血清免疫球蛋白含量的变化.结果 CⅡ3及HFDT1能抑制小鼠L1210瘤的生长且不降低荷瘤小鼠的体重;CⅡ3及HFDT1能有效的上调荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数,能显著提高荷瘤小鼠外周血免疫细胞的数量;能维持脾脏淋巴细胞含量,调节T、B淋巴细胞和CD3+ CI4+细胞与CD3+ CD8+T的比例;能够提高血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的水平.结论 美洲大蠊精制物CⅡ3及相关合成短肽HFDT1可通过增强荷瘤小鼠抗肿瘤免疫功能,发挥抗肿瘤活性,有望成为低毒有效的抗肿瘤候选药,特别是HFDT1,因能够通过人工方法大量合成,具有很大的应用前景.

目的:探索美洲大蠊促创面愈合相关活性物质.方法:采用多种色谱法分离纯化其非肽类小分子化合物,并借助谱学法鉴定其化学结构.结果:从中分离得到16个化合物,分别为2-(1,2,3-三羟基丙基)吡嗪(1)、 2-甲基-6-(2,3,4-三羟基丁基)吡嗪(2)、3-甲基-6-(2,3,4-三羟基丁基)吡嗪(3)、3-羟基吡啶(4)、1-(2-羟乙基)-5-羟甲基-1H-吡咯-2-醛(5)、N-(5-乙酰吡咯-3-基)乙酰胺(6)、8-羟基-2,3-二氢1H)-喹诺酮(7)、戊内酰胺 (8)、N-乙酰多巴胺(9)、aspongopusin(10)、 deoxyhyrtiosine A(11)、光色素(12)、6-羟甲基-3-羟基吡啶(13)、3,4-二羟基苯基甘油(14)、2-异戊基苯酚(15)和5-羟甲基呋喃-2-醛(16).结论:化合物1、3、5和6为新的天然产物,化合物2、4、7、10~16为首次从美洲大蠊中分离得到;生物活性研究表明化合物12～14能促进人皮肤成纤维细胞迁移,尤以化合物13作用最为显著,而化合物3可促进人脐静脉内皮细胞血管生成.

目的:探讨美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用.方法:通过小鼠腋窝皮下注射H22肝癌小鼠腹水构建荷瘤小鼠模型.将70只小鼠随机分为模型组(生理盐水)、5-氟尿嘧啶组(阳性药对照,20 mg/kg)以及美洲大蠊提取物的脱脂膏组(200 mg/kg,以提取物量计)、CⅡ-3组(从浸膏中提取的以多肽为主要活性成分的组分,200 mg/kg,以提取物量计)和多肽PAP-2高、中、低剂量组(从CⅡ-3中分离得到,200、100、50 mg/kg,以单体量计),每组10只.5-氟尿嘧啶组小鼠隔天腹腔注射给药1次,其余各组小鼠均每天灌胃给药1次,给药周期均为10 d.给药结束后,观察小鼠瘤块变化并测定其脏器(脾、胸腺、肝)指数,苏木精-伊红染色后观察其瘤组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验法测定其血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-4的含量.结果:脱脂膏、CⅡ-3和不同剂量的PAP-2均能不同程度地抑制荷瘤小鼠瘤块的生长并升高其脏器指数,且PAP-2的作用具有一定的量效关系.其中,PAP-2高剂量组的抑瘤率(38.95％)显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),并与5-氟尿嘧啶组(40.87％)接近(P>0.05);PAP-2高剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、肝指数较模型组均显著升高(P<0.05),并显著高于CⅡ-3组(P<0.05),且其肝指数显著高于脱脂膏组(P<0.05).此外,PAP-2还可降低荷瘤小鼠血清中VEGF和IL-4含量、升高其血清中IL-1β含量,其中PAP-2高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05);并且PAP-2高剂量组小鼠血清中IL-1β含量显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),IL-4含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),但是其血清中VEGF含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05).结论:美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用,可升高其脏器指数,降低其血清中VEGF、IL-4含量并升高其血清中IL-1β含量.

目的:探讨美洲大蠊多肽对血管生成的作用,探讨其机制.方法:以人脐静脉内皮细胞HUVECs和人肝癌HepG2细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)比色法和细胞划痕实验,观察不同质量浓度(6.25,12.5,25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊多肽(PAP-1 ～3),脱脂膏和美洲大蠊多肽前体物CⅡ-3对HUVECs增殖、迁移的影响,另设正常组和沙利度胺组;采用小管形成实验检测各组HUVECs小管形成能力;通过细胞间黏附实验,观察不同质量浓度(25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊提取物处理后人肝癌HepG2细胞同HUVECs之间黏附能力;利用免疫细胞化学染色和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组HUVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达.结果:MTT比色法结果显示,多肽均能抑制HUVECs的增殖(P＜0.05),呈剂量依赖关系.不同质量浓度多肽分别作用24,48,72 h,PAP-2的抑制作用优于PAP-1,PAP-3 (P ＜0.05).不同质量浓度的CⅡ-3和脱脂膏作用,HUVECs的存活率明显升高.细胞划痕实验结果显示多肽均能抑制HUVECs迁移(P＜0.05),且随药物浓度的增加,抑制迁移的作用也越强.其中PAP-2的作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05);CⅡ-3在一定程度上能抑制HUVECs迁移,但是剂量越大,抑制作用越弱;脱脂膏作用后,HUVECs迁移能力增强.小管生成实验结果显示,多肽均能抑制HUVECs小管形成(P＜0.05),且随着给药浓度的增大,抑制作用越强.其中,PAP-2对小管形成的抑制作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05).CⅡ-3和脱脂膏一定程度上促进HUVECs小管的形成.细胞间黏附实验结果显示,多肽均能阻断HepG2同HUVECs之间的黏附(P＜0.05),其中PAP-2对HepG2同HUVECs间黏附的阻断作用强于PAP-1和PAP-3 (P ＜0.05).相反,CⅡ-3和脱脂膏在一定程度上却能促进HepG2同HUVECs间黏附.免疫细胞化学染色和ELISA实验结果显示,多肽均能够下调HUVECs细胞中VEGF含量(P＜0.05),且呈浓度依赖性.其中,PAP-2对VEGF的下调作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05).而CⅡ-3和脱脂膏能上调HUVECs中VEGF的表达.结论:美洲大蠊多肽对HUVECs的侵袭和转移,分化形成小管的能力有一定抑制作用,并能下调细胞中VEGF蛋白的表达.其中,美洲大蠊多肽的作用优于CⅡ-3和脱脂膏,多肽中PAP-2的作用较优.

目的 对美洲大蠊肠道内生分枝杆菌进行形态学和分子生物学鉴定,初步研究其抑菌活性并筛选其次级代谢产物生物合成基因簇. 方法 采用平板划线法对美洲大蠊肠道内生分枝杆菌进行分离、纯化及革兰染色检查;PCR扩增其16S rDNA并测序,进行BLAST比对及系统发育树分析,对生物合成基因簇聚酮合酶(PKS Ⅰ)基因、非核糖体肽合成酶(NRPS)基因与FADH2依赖型卤化酶基因进行初步筛选.采用牛津杯法初步测定分离菌对常见致病菌的抑菌活性. 结果 从美洲大蠊肠道分离到4株内生分枝杆菌,在高氏Ⅰ号培养基上形成的菌落较小,颜色呈橘红色,革兰染色呈紫色;系统发育树分析表明,4株分枝杆菌与已知分枝杆菌相似度均在99％以上,且与植物、土壤及临床标本来源的分枝杆菌亲缘关系较近.4株美洲大蠊肠道内生分枝杆菌的生物合成基因PKS Ⅰ表达均呈阳性,其中3株菌的NRPS基因表达呈阳性.抑菌试验显示,其中3株分枝杆菌均对8株常见致病菌表现出不同程度的选择性抑制作用. 结论 美洲大蠊肠道内生分枝杆菌具有抑菌活性,可能具有产聚酮类或多肽类等活性物质的潜力.

本研究探讨了美洲大蠊多肽PAE2逆转人肝细胞肿瘤耐药细胞株BEL-7402/5-FU的多药耐药性作用及机制.以人肝细胞肿瘤敏感细胞株BEL-7402、人肝细胞肿瘤耐5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞株BEL-7402/5-FU和Balb/c-nude小鼠为研究对象,采用噻唑蓝比色分析法检测BEL-7402/5-FU 细胞的多药耐药性和交叉耐药性,通过激光共聚焦显微镜观察阿霉素在BEL-7402/5-FU 细胞中的累积.使用实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫细胞化学染色法检测BEL-7402/5-FU 细胞中 P-糖蛋白 1(P-glycoprotein 1,P-gp1)、多药耐药相关蛋白 1(multi-drug resistance protein 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白1(lung resistance protein 1,LRP1)以及乳腺癌耐药蛋白 1(breast cancer resistance protein 1,BCRP1)的 mRNA 和蛋白的相对表达量,确定美洲大蠊多肽PAE2逆转多药耐药性的机制.此外,在Balb/c-nude小鼠中,建立BEL-7402/5-FU细胞的腋下移植瘤模型,观察美洲大蠊多肽PAE2对腋下移植瘤小鼠的免疫器官、肝肾功能、肿瘤抑制与诱导肿瘤细胞调亡、调节肿瘤组织多药耐药相关蛋白等环节的影响.结果显示,美洲大蠊多肽PAE2能有效逆转BEL-7402/5-FU细胞的多药耐药性和交叉耐药性,作用机制可能与下调多药耐药相关蛋白的表达水平有关,降低了多药耐药细胞对抗肿瘤药物的外排能力、影响抗肿瘤药物分子代谢,从而达到逆转人肝细胞癌多药耐药的作用.

目的:探讨美洲大蠊多肽PAE2体内逆转肝癌多药耐药(MDR)的作用及机制.方法:采用Balb/c-nude小鼠腋下接种HepG2和HepG2/ADM细胞分别建立肝癌敏感株动物模型和肝癌MDR动物模型,模型制备成功后,将裸鼠随机分为正常组,HepG2模型组,HepG2/ADM模型组,索拉菲尼组[30mg·kg-1,灌胃(ig)],HepG2/ADM+PAE2[静脉注射(iv)]低、中、高剂量组(50,100,200 mg·kg-1),HepG2/ADM+PAE2ig低、中、高剂量组(50,100,200 mg·kg-1),脱脂膏组(200 mg·kg-1,ig),美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3组(200 mg·kg-1,ig),每2日测量1次裸鼠体质量及肿瘤体积,并记录,末次给药后,次日取裸鼠肿瘤组织,记录瘤质量,采用免疫组织化学(IHC)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定美洲大蠊多肽PAE2对肿瘤组织中P糖蛋白(P-gp),肺耐药相关蛋白(LRP),乳腺癌耐药蛋白(BCRP),蛋白激酶C(PKC),谷胱甘肽巯基转移酶-π(GST-π),拓扑异构酶Ⅱ (ToPoⅡ ),MDR基因1(MDR1)及MDR相关蛋白1(MRP1)蛋白水平和基因水平表达的影响.另同时设置口服和静脉2种给药组别以研究美洲大蠊PAE2的基本药代动力学特征.结果:裸小鼠体质量方面,造模成功后,与正常组比较,裸小鼠体质量明显减轻(P＜0.05),经各药物治疗后,体质量有一定回升,但仍然不及正常裸小鼠.抑瘤作用方面,与模型组比较,美洲大蠊多肽PAE2iv组中剂量组抑瘤效果最好(P＜0.05),口服给药组抑瘤作用随剂量的增加而增加,高剂量组效果最好(P＜0.05),美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3无明显抑瘤作用,脱脂膏具有一定的抑瘤效果(P＜0.05).MDR相关蛋白和酶方面,美洲大蠊多肽PAE2在体内对MDR相关的蛋白和酶均有一定影响,主要可能通过抑制肿瘤组织内LRP,BCRP表达和不同程度影响上述相关蛋白、基因表达而抑制细胞内药物外排,从而促进肿瘤凋亡,且作用优于美洲大蠊前期粗提物CⅡ-3和脱脂膏.结论:美洲大蠊多肽PAE2可能通过影响介导MDR的相关蛋白和酶的表达,减少药物外排,促进细胞内药物累积、细胞凋亡,从而发挥逆转HepG2/ADM细胞Balb/c-nude小鼠移植瘤MDR的作用.

美洲大蠊是传统动物类中药"蜚蠊"的重要基源药材之一,传统功效主要包括通利血脉、敛疮生肌、利水消肿、健脾消疳等.由于其疗效确切,以其为主要原料的中成药在临床上广泛使用,尤其在各种创面的修复上,疗效显著.该药物目前尚未被《中华人民共和国药典》收录,地方标准也仅是以总氨基酸中的丙氨酸含量为质控标准,具有生理活性的小分子肽类、核苷、蛋白质等物质均没有得到相应的定性或定量控制.近年来从美洲大蠊分离出的多肽类单体如抗菌肽、神经肽、利尿肽,具有抗菌、抗肿瘤、肌神经营养等强大的药理活性;二氢异香豆素类化合物还具有刺激人真皮成纤维细胞产生胶原蛋白的作用.基于此,本文使用Pubmed,CNKI,万方数据库检索美洲大蠊1984-2019年相关研究性文献,从化学成分-药理作用-临床应用3个方面对美洲大蠊目前的研究进行系统分析阐释,为该药物的进一步开发及以其为主要原料药的中成药制定更具专属性、稳定性的质控标准提供参考.