目的 探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3对肝癌经导管动脉栓塞(transcatheter arterial embolization,TAE)术后癌旁肝组织细胞黏附分子水平的影响及其对肝脏的保护作用.方法 东南大学荷瘤兔2只,新西兰大白兔50只.开腹瘤粒注射法建立兔VX2肝癌模型,影像学确认是否造模成功并评估肿瘤种植情况.将成功建模的45只实验兔随机分为3组,每组15只.对照组不做处理,TAE组用碘化油栓塞肿瘤供血动脉,CⅡ-3组于TAE术前连续3 d耳缘静脉注射CⅡ-3(16 mg/kg).化学比色法检测各组实验兔术前及术后血清ALT及AST.免疫组化法检测各组癌旁肝组织PPAR-α、NF-κB表达水平.ELISA法检测各组癌旁肝组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)水平.RT-PCR检测各组癌旁肝组织PPAR-α、NF-κB、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达水平.结果 术前对照组、TAE组、CⅡ-3 组 ALT水平分别为(34.49±1.33)、(34.01±1.21)、(34.06±1.23)U/L,AST水平分别为(38.44±1.41)、(38.45±1.47)、(38.42±1.38)U/L,差异无统计学意义(P＞0.05);术后对照组、TAE组、CⅡ-3组ALT水平分别为(35.61±1.56)、(118.67±3.39)、(87.24±3.67)U/L,AST水平分别为(41.03±1.83)、(220.60±3.00)、(104.46±2.66)U/L;与对照组比较,TAE组、CⅡ-3组ALT及AST水平明显上升,但CⅡ-3组ALT及AST水平低于TAE组,差异均有统计学意义(P＜0.01).对照组、TAE组、CⅡ-3组ICAM-1水平分别为(1.74±0.13)、(3.43±0.19)、(1.81±0.13)ng/L;VCAM-1 水平分别为(1.66±0.05)、(2.18±0.06)、(1.67±0.06)ng/L.对照组、TAE组、CⅡ-3组PPAR-α阳性分别为4、3、10只,NF-κB阳性分别为2、11、3只,与对照组、CⅡ-3组比较,TAE组NF-κB阳性率、NF-κB mRNA水平和ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA水平明显升高;与对照组、TAE组比较,CⅡ-3组PPAR-α蛋白及mRNA水平明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 CⅡ-3可通过拮抗NF-kB的表达,降低ICAM-1、VCAM-1水平,达到减轻炎症反应,降低TAE术后肝损伤的作用.

目的:探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏对肝癌耐5-氟尿嘧啶细胞(BEL-7402/5-FU)自噬和转移侵袭能力的影响.方法:以肝癌敏感细胞BEL-7402和肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU作为实验对象,给予索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏处理,检测自噬标志蛋白的生成,同时检测细胞中自噬相关因子和侵袭转移相关因子的水平以及细胞侵袭转移能力的变化.结果:耐药细胞组中p62蛋白低表达,给予阳性药索拉菲尼、CⅡ-3和脱脂膏后,细胞中p62蛋白表达量明显升高.和敏感细胞相比,耐药细胞中LC3B生成增多,给予CⅡ-3后LC3B生成减少.CⅡ-3和脱脂膏给药组均能明显抑制自噬和侵袭转移的部分相关因子的表达,包括降低ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B、MMP-9、Akt、4EBP1 mRNA表达.划痕试验结果显示,相比于敏感细胞,耐药细胞具有更强的侵袭转移能力,给予索拉菲尼和CⅡ-3作用后均可显著抑制细胞的侵袭转移,而脱脂膏则无显著的抑制效果.结论:肝癌耐药细胞具有很强的自噬和侵袭转移能力,而美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏体外均能明显抑制耐药细胞的自噬和侵袭转移,但仅能影响部分相关因子.

目的:探讨美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用.方法:通过小鼠腋窝皮下注射H22肝癌小鼠腹水构建荷瘤小鼠模型.将70只小鼠随机分为模型组(生理盐水)、5-氟尿嘧啶组(阳性药对照,20 mg/kg)以及美洲大蠊提取物的脱脂膏组(200 mg/kg,以提取物量计)、CⅡ-3组(从浸膏中提取的以多肽为主要活性成分的组分,200 mg/kg,以提取物量计)和多肽PAP-2高、中、低剂量组(从CⅡ-3中分离得到,200、100、50 mg/kg,以单体量计),每组10只.5-氟尿嘧啶组小鼠隔天腹腔注射给药1次,其余各组小鼠均每天灌胃给药1次,给药周期均为10 d.给药结束后,观察小鼠瘤块变化并测定其脏器(脾、胸腺、肝)指数,苏木精-伊红染色后观察其瘤组织病理变化,并采用酶联免疫吸附试验法测定其血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-4的含量.结果:脱脂膏、CⅡ-3和不同剂量的PAP-2均能不同程度地抑制荷瘤小鼠瘤块的生长并升高其脏器指数,且PAP-2的作用具有一定的量效关系.其中,PAP-2高剂量组的抑瘤率(38.95％)显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),并与5-氟尿嘧啶组(40.87％)接近(P>0.05);PAP-2高剂量组小鼠脾指数、胸腺指数、肝指数较模型组均显著升高(P<0.05),并显著高于CⅡ-3组(P<0.05),且其肝指数显著高于脱脂膏组(P<0.05).此外,PAP-2还可降低荷瘤小鼠血清中VEGF和IL-4含量、升高其血清中IL-1β含量,其中PAP-2高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05);并且PAP-2高剂量组小鼠血清中IL-1β含量显著高于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),IL-4含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05),但是其血清中VEGF含量显著低于脱脂膏组和CⅡ-3组(P<0.05).结论:美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用,可升高其脏器指数,降低其血清中VEGF、IL-4含量并升高其血清中IL-1β含量.

目的:探讨美洲大蠊多肽对血管生成的作用,探讨其机制.方法:以人脐静脉内皮细胞HUVECs和人肝癌HepG2细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)比色法和细胞划痕实验,观察不同质量浓度(6.25,12.5,25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊多肽(PAP-1 ～3),脱脂膏和美洲大蠊多肽前体物CⅡ-3对HUVECs增殖、迁移的影响,另设正常组和沙利度胺组;采用小管形成实验检测各组HUVECs小管形成能力;通过细胞间黏附实验,观察不同质量浓度(25,50,100 mg·L-1)的美洲大蠊提取物处理后人肝癌HepG2细胞同HUVECs之间黏附能力;利用免疫细胞化学染色和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测各组HUVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达.结果:MTT比色法结果显示,多肽均能抑制HUVECs的增殖(P＜0.05),呈剂量依赖关系.不同质量浓度多肽分别作用24,48,72 h,PAP-2的抑制作用优于PAP-1,PAP-3 (P ＜0.05).不同质量浓度的CⅡ-3和脱脂膏作用,HUVECs的存活率明显升高.细胞划痕实验结果显示多肽均能抑制HUVECs迁移(P＜0.05),且随药物浓度的增加,抑制迁移的作用也越强.其中PAP-2的作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05);CⅡ-3在一定程度上能抑制HUVECs迁移,但是剂量越大,抑制作用越弱;脱脂膏作用后,HUVECs迁移能力增强.小管生成实验结果显示,多肽均能抑制HUVECs小管形成(P＜0.05),且随着给药浓度的增大,抑制作用越强.其中,PAP-2对小管形成的抑制作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05).CⅡ-3和脱脂膏一定程度上促进HUVECs小管的形成.细胞间黏附实验结果显示,多肽均能阻断HepG2同HUVECs之间的黏附(P＜0.05),其中PAP-2对HepG2同HUVECs间黏附的阻断作用强于PAP-1和PAP-3 (P ＜0.05).相反,CⅡ-3和脱脂膏在一定程度上却能促进HepG2同HUVECs间黏附.免疫细胞化学染色和ELISA实验结果显示,多肽均能够下调HUVECs细胞中VEGF含量(P＜0.05),且呈浓度依赖性.其中,PAP-2对VEGF的下调作用优于PAP-1和PAP-3(P＜0.05).而CⅡ-3和脱脂膏能上调HUVECs中VEGF的表达.结论:美洲大蠊多肽对HUVECs的侵袭和转移,分化形成小管的能力有一定抑制作用,并能下调细胞中VEGF蛋白的表达.其中,美洲大蠊多肽的作用优于CⅡ-3和脱脂膏,多肽中PAP-2的作用较优.

目的:初步研究美洲大蠊提取物CⅡ-3对上皮肿瘤细胞MFC荷瘤小鼠的抑瘤机制.方法:将Balb/c小鼠随机分为模型组(生理盐水20 mL/kg)和CⅡ-3组(200 mg/kg),每组6只.在小鼠右侧腋下注射MFC细胞悬液0.2 mL后,于次日灌胃相应药物,每日1次,连续10 d.末次给药24 h后,在测量瘤体大小的基础上,采用氢-1核磁共振技术(1H-NMR)并结合非监督型主成分分析(PCA)、监督型偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),比较两组荷瘤小鼠肝组织的代谢谱并分析差异性代谢物,探索CⅡ-3抑瘤作用的潜在机制.结果:与模型组比较,CⅡ-3组荷瘤小鼠的瘤体明显减小;两组小鼠的1H-NMR图谱存有差异;结合非监督型PCA、监督型PLS-DA、OPLS-DA结果,共确定了肝组织潜在差异性代谢物6个,分别为糖原(升高)、丙酮酸(降低)、精氨酸(降低)、羟脯氨酸(升高)、肌苷(升高)、烟酰胺(升高),主要归属于精氨酸代谢、能量代谢和核酸代谢.结论:CⅡ-3对MFC荷瘤小鼠的抑瘤作用可能与调节精氨酸代谢、能量代谢和核酸代谢有关.

目的:研究美洲大蠊提取物脱脂膏及CⅡ-3(分别简称"脱脂膏""CⅡ-3")逆转耐阿霉素(ADM)人肝癌细胞HepG2/ADM多药耐药的作用机制.方法:采用MTT法考察不同质量浓度索拉非尼(阳性对照)、脱脂膏和CⅡ-3对HepG2/ADM细胞的毒性作用,并计算20％抑制浓度(IC20).试验设置敏感组、耐药组、索拉非尼组、脱脂膏组和CⅡ-3组,敏感组使用HepG2细胞,后4组均使用HepG2/ADM细胞.敏感组和耐药组细胞给予常规培养基,其余3组细胞给予相应药物(浓度均为IC20).采用激光扫描共聚焦显微技术测定细胞中ADM含量;采用Western blotting法测定细胞中凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、剪切型胱天蛋白酶9 p37(Cleaved-Caspase-9 p37)]的表达水平;分别采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法和免疫细胞化学染色法检测细胞中多药耐药相关基因mRNA及蛋白[P-糖蛋白(P-gp)(MDR1基因表达产物)、肺耐药蛋白(LRP)、乳腺癌耐药相关蛋白(BCRP)]和酶介导多药耐药途径中相关基因mRNA及蛋白[谷胱甘肽转移酶(GST-π)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)]的表达水平.结果:索拉非尼、脱脂膏、CⅡ-3对HepG2/ADM细胞的IC20分别为(2.40±0.16)、(200.44±27.52)、(18.00±1.82)μg/mL.与敏感组比较,耐药组细胞中Bcl-2、P-gp、LRP、BCRP、TopoⅡ蛋白表达水平以及MDR1、LRP、BCRP、GST-πmRNA表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01).与耐药组比较,脱脂膏组和CⅡ-3组细胞中ADM含量显著增加(P<0.05或P<0.01),MDR1 mRNA表达水平和LRP、BCRP、GST-πmRNA及其蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01);CⅡ-3组细胞中Bcl-2蛋白表达水平、TopoⅡmRNA表达水平均显著降低(P<0.01),Cleaved-Caspase-9 p37蛋白表达水平显著升高(P<0.05).结论:脱脂膏、CⅡ-3可通过减少药物外排、促进细胞凋亡、减少多药耐药相关基因和酶介导多药耐药途径中相关基因的mRNA及其蛋白的表达等方式,逆转HepG2/ADM细胞的多药耐药性,且CⅡ-3的效果优于脱脂膏.

目的:研究美洲大蠊提取物CⅡ-3与其体外抗肝癌活性的谱效关系,并初步明确其抗肝癌活性成分.方法:在已建立10批CⅡ-3样品的超高效液相色谱(UHPLC)指纹图谱的基础上,借助超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用法(UHPLC-Q-TOF/MS),通过标准品和相关文献定性鉴定各色谱峰对应的化合物;以各批CⅡ-3样品对人肝癌细胞HepG2的半数抑制浓度(IC50)为抗肝癌活性指标,采用灰色关联度分析法(GRA)与正交偏最小二乘法(OPLS)建立并分析指纹图谱与抗肝癌活性之间的谱效关系.结果:10批CⅡ-3样品的UHPLC指纹谱图中有共有峰25个,指认出其中10个,分别为环(酪氨酸-脯氨酸)(峰24)、环(甘氨酸-苯丙氨酸)(峰15)、次黄嘌呤(峰3)、腺嘌呤(峰7)、苯丙氨酸(峰10)、肌苷(峰11)、N-乙酰多巴胺(峰16)、环(脯氨酸-丙氨酸)(峰13)、2-羟基马尿酸(峰22)、环(脯氨酸-丝氨酸)(峰6).10批CⅡ-3样品对HepG2细胞的IC50为70.550～200.303μg/mL.25个共有峰中,以抗肝癌活性的GRA分析关联度(r)排序为峰20>23>24>15,且其r值均大于0.7;以OPLS分析变量重要性投影(VIP)值排序为峰23>18>15>24>7>14>6>2>20,且VIP值均大于1,其中峰7、15、20、23、24的标准回归系数均大于0,峰2、6、14、18的标准回归系数均小于0.联合分析显示,CⅡ-3样品抗肝癌活性主要成分依次为峰20>23>24>15.结论:CⅡ-3中两个未知化合物(峰20、23)和环(酪氨酸-脯氨酸)(峰24)、环(甘氨酸-苯丙氨酸)(峰15)可能是其抗肝癌活性的主要成分.

目的 探讨美洲大蠊多肽PAP-2 对肝癌缺氧微环境的影响,及其作用机制.方法 BALb/c裸鼠用腋下接种HepG2 肝癌细胞的方法构建肝癌原位移植瘤模型.将造模成功的裸小鼠随机分为模型组、阳性对照组(20 mg·kg-1 5-氟尿嘧啶)、CⅡ-3 组(200 mg·kg-1 美洲大蠊提取物CⅡ-3)、脱脂膏组(200 mg·kg-1 美洲大蠊脱脂膏)和低、中、高剂量 PAP-2 组(50、100 和 200 mg·kg-1 美洲大蠊多肽PAP-2)及低、中、高剂量联合组(20 mg·kg-1 5-氟尿嘧啶+50、100 和200 mg·kg-1 美洲大蠊多肽PAP-2),每组 10 只.各组小鼠均按0.1 mL·10 g-1 的剂量腹腔注射给药,除模型组和阳性对照组隔天 1 次外,其余各组每天 1 次,共计 10 d.检测裸鼠移植瘤的抑瘤率和脏器指数,用实时荧光定量聚合酶链反应法检测肿瘤组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平.结果 高剂量PAP-2 组、高剂量联合组、CⅡ-3 组、脱脂膏组和阳性对照组的抑瘤率分别为 62.19%、78.07%、52.14%、51.11%和53.73%.高剂量PAP-2 组、高剂量联合组、CⅡ-3 组、脱脂膏组、阳性对照组和模型组的脾指数分别为(129.98±3.97)、(139.98±14.18)、(66.48±6.93)、(64.90±5.31)、(108.61±11.32)和(45.47±6.42)mg·g-1,肝指数分别为(843.10±59.41)、(1 112.62±37.28)、(720.68±77.70)、(709.77±51.80)、(927.66±69.19)和(497.21±59.81)mg·g-1,HIF-1α mRNA表达量分别 0.96±0.09、0.55±0.22、0.97±0.29、0.86±0.22、0.88±0.32和 1.28±0.22,VEGF mRNA表达量分别为0.75±0.29、0.23±0.07、0.84±0.18、0.90±0.21、0.69±0.21 和 1.12±0.12.高剂量联合组、高剂量PAP-2 组、CⅡ-3 组、脱脂膏组和阳性对照组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 美洲大蠊多肽PAP-2 通过抑制相关血管生成因子的表达水平,抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞迁移,改善肝癌缺氧微环境.