目的:探讨基于甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）仿生微环境与悬滴法三维培养小鼠毛乳头细胞（DPC）制备仿生毛乳头球的生物活性及其在裸鼠中的毛发诱导功能。方法:采用实验研究方法。采用酶消化法获取雄性5~6周龄C57BL/6J小鼠触须毛的DPC以及1 d龄C57BL/6J小鼠皮肤角质形成细胞（KC），经免疫荧光法鉴定前者第3代细胞稳定表达DPC标志物神经细胞黏附分子、碱性磷酸酶（ALP）、β连环蛋白及α平滑肌肌动蛋白，后者原代细胞稳定表达KC标志物角蛋白15。取第8代DPC，用GelMA重新悬浮并接种至Transwell孔板插件底面，光交联后倒置培养，于光学显微镜下观察培养0（即刻）、3 d GelMA悬滴中DPC聚集情况（聚集成球即仿生毛乳头球），采用活/死染色试剂盒检测培养3 d仿生毛乳头球中细胞活性。将传统二维培养的原代DPC、第8代DPC以及按前述方法制备的仿生毛乳头球分别设为原代DPC组、第8代DPC组、仿生毛乳头球组，利用高通量测序技术平台对每组培养3 d的3个样本中DPC进行转录组测序，利用基迪奥生物信息云工具平台（OmicShare Tools）对转录组数据进行主成分分析、Pearson相似性分析、差异表达基因筛选，利用时间序列趋势分析软件对差异表达基因进行表达模式聚类分析，利用基迪奥生物信息云工具平台对具有特定表达模式的差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析。同前进行细胞分组，采用随机数字表法从差异表达基因中抽取性别决定区Y框蛋白8（ SOX8）、基质金属蛋白酶9（ MMP- 9）、26型胶原纤维α1（ COL26A1）、无翅型MMTV整合位点家族成员6（ Wnt6），采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法验证差异表达基因mRNA表达情况与测序结果的一致性（样本数为9）；采用实时荧光定量RT-PCR法检测DPC生物功能标志物成纤维细胞生长因子7（FGF7）、Wnt10a、淋巴样增强因子1（LEF1）、ALP、β连环蛋白、多功能蛋白聚糖、SOX2的mRNA表达情况（样本数为9）。取3只5~6周龄雄性BALB/c裸鼠，分别设为原代DPC组、第8代DPC组、仿生毛乳头球组，将原代DPC、第8代DPC、仿生毛乳头球分别与原代KC以2∶1细胞数比例混合后分别注射至相应组别裸鼠皮下，每只注射6个区域。注射后2周，取注射区域全厚皮，计数再生毛发，行苏木精-伊红染色后观察再生毛囊情况。对数据行单因素方差分析、Tukey检验并进行Bonferroni校正。 结果:培养3 d，DPC在GelMA悬滴中由培养0 d的分散状态聚集成仿生毛乳头球，制备的仿生毛乳头球中细胞活性良好。培养3 d，主成分分析显示，相比于第8代DPC组，原代DPC组、仿生毛乳头球组组内样本间变异程度较低，仿生毛乳头球组与原代DPC组组间样本变异程度最低，3组DPC样本超过90%的基因谱数据变异可由第1个和第2个主要成分来解释；Pearson相似性分析显示，组内样本重复性好，原代DPC组和仿生毛乳头球组样本间的相关系数为0.84~0.95，原代DPC组和第8代DPC组样本间的相关系数为0.72~0.87；3组DPC间差异表达基因分析筛选出642个组间交集差异表达基因，对其进行表达模式聚类显示有2种基因表达模式有显著趋势（ P<0.05），分别为第8代DPC组基因表达显著低于原代DPC组/仿生毛乳头球组、第8代DPC组基因表达显著高于原代DPC组/仿生毛乳头球组，共包含411个差异表达基因；KEGG富集分析显示这411个差异表达基因在Wnt信号通路以及磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信号通路显著富集（ P<0.05），GO富集分析表明细胞外基质、经典Wnt信号通路、细胞分化等GO术语被显著富集（ P<0.05）。与原代DPC组、仿生毛乳头球组比较，第8代DPC组细胞基因 SOX8、MMP- 9、COL26A1、Wnt6 mRNA表达量均明显下降（ q=15.950、8.854、11.890、11.050，9.851、5.884、7.418、4.870， P<0.01），与测序数据一致。与原代DPC组、仿生毛乳头球组比较，第8代DPC组细胞生物功能标志物FGF7、Wnt10a、LEF1、ALP、β连环蛋白、多功能蛋白聚糖、SOX2 mRNA表达量均明显下降（ q=11.470、9.795、4.165、9.242、10.970、10.570、8.005，7.472、4.976、3.651、4.784、5.236、6.825、5.214， P<0.05或 P<0.01）。注射后2周，第8代DPC组裸鼠无毛发再生，仿生毛乳头球组与原代DPC组裸鼠再生毛发数量相近（ q=1.852， P>0.05）且均显著高于第8代DPC组（ q=18.980、17.130， P<0.01）；第8代DPC组裸鼠注射区域皮肤仅形成了坏死灶，而仿生毛乳头球组与原代DPC组裸鼠注射区域皮肤均观察到再生毛囊且毛囊横断切面有黑色素沉着。 结论:基于GelMA仿生微环境与悬滴法三维培养小鼠DPC制备仿生毛乳头球的培养模型可一定程度上恢复高传代DPC在裸鼠中的毛发诱导能力，且其生物特性更加类似于原代DPC，可实现DPC的扩增后特性恢复。

目的:探讨CXXC型锌指蛋白4基因(CXXC4)对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)检测江苏省苏北人民医院2015年1月至2019年12月诊治的100例胃癌患者(胃癌组)和50例胃良性疾病患者(良性组)CXXC4基因甲基化并分析其与临床病理因素关系。设计合成靶向CXXC4基因的甲基化寡核苷酸转染至SGC7901胃癌细胞(转染甲基化寡核苷酸组，MON组)，选择未转染甲基化寡核苷酸细胞为对照(未转染寡核苷酸，CON组)，单因素方差分析比较两组细胞CXXC4基因甲基化及信使核糖核酸(mRNA)表达、吸光度( A)值、细胞周期及凋亡、果蝇无翅基因(Wnt)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和c-Myc基因mRNA表达。两组间比较采用 t或 χ2检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用SNK- q法分别比较组间差异。 结果:胃癌组患者CXXC4基因甲基化率显著高于CON组(67.0%比14.0%， χ2＝35.371， P<0.01)，差异有统计学意义。SGC7901胃癌细胞中CXXC4为未甲基化状态。胃癌组患者CXXC4基因甲基化率在分化程度、肿瘤T分期、淋巴结转移及肿瘤分期方面的差异有统计学意义( χ2＝4.626、4.075、5.294、5.619， P值均<0.05)。MON组SGC7901胃癌细胞第1～6天 A值、S期、G 2/M期、增殖指数、Wnt、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc基因mRNA相对表达量显著高于CON组( t＝7.324、9.238、8.789、11.233、8.018、10.383、27.899、34.461、21.432、20.137、31.654、27.439、36.872， P<0.01)，差异有统计学意义，CXXC4基因mRNA表达、G 0/G 1期和凋亡率显著低于CON组( t＝55.637、45.256、32.009， P<0.01)，差异有统计学意义。 结论:CXXC4基因甲基化与胃癌发病机制及临床病理因素有相关。CXXC4基因甲基化上调Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖并抑制凋亡。

海南岛是与周边大陆存在地理隔离的大陆性岛屿,探索该岛屿与邻近大陆上生物的遗传分化有助于理解地理隔离对生物遗传分化的影响.在海南岛及其周边大陆 15 个地点采集两种鳞翅目天蛾科(Lepidoptera:Sphingidae)昆虫(绿带闭目天蛾Callambulyx rubricosa 88 头和构月天蛾Parum colligata 57 头),选择线粒体基因COI、Cytb和核基因 EF-1α作为分子标记开展遗传多样性研究.基于COI-Cytb分析的结果表明,两物种的核苷酸多样性均较低(分别为 0.00434 和 0.00818),且均在广东广西、越南和海南岛群体之间存在明显的谱系地理结构.两个物种在三个群体间均检测出低水平的基因流(Nm分别为0.09-1.22 和0.18-0.57)和高水平的遗传分化(FST分别为 0.29-0.84 和 0.47-0.73).两个物种最高的遗传分化都发生在海南岛与大陆群体之间,且海南岛群体的单倍型数量少于周边大陆群体.Mantel检验结果表明遗传距离与地理距离之间存在显著正相关关系,中性检验结果表明两个物种均未经历显著的种群扩张.综上,研究认为绿带闭目天蛾(C.rubricosa)和构月天蛾(P.colligata)的海南岛群体与邻近大陆群体间的基因交流较少,遗传分化程度较高,推测地理隔离可能是其产生遗传分化的重要原因之一,这一结果将为海南岛生物多样性的保护提供宝贵的建议.

昆虫翅多型作为生物可塑性发育的典型代表,是昆虫对复杂多变环境适应进化的结果.褐飞虱Nilaparvata lugens是一种典型的翅多型昆虫,若虫可发育成短翅型或长翅型成虫,后者的远距离迁飞特性造成褐飞虱在亚洲稻区大面积为害.20世纪60年代以来,前人针对褐飞虱翅多型的发生机理进行了大量研究,发现种群密度、寄主植物质量、温度和光周期等诸多环境因子以及保幼激素均能够影响翅型比例.近20年来,得益于基因组学、RNAi和基因编辑等生物技术的发展,褐飞虱翅型分化的分子机制研究取得了突破性进展,发现了褐飞虱翅型分化的开关基因FoxO,沉默或敲除FoxO会导致飞虱发育为长翅型;而胰岛素信号通路能够磷酸化FoxO抑制其进入细胞核,从而参与翅型分化调控;锌指转录因子Zfh1能够以启动子结合的方式调节FoxO的转录,与胰岛素信号通路平行调控翅型分化;另一个锌指转录因子Rotund能够与FoxO互作共同调控褐飞虱翅多型.此外,性别决定基因Trransformer-2和c-Jun氨基末端激酶通路等也能够影响翅型分化,表明褐飞虱的翅型分化存在多样化的分子调控机制.鉴于半翅目不同亚目间的翅多型机制均有所不同,对褐飞虱翅型分化机制的解析远不足以阐明半翅目乃至整个昆虫纲的翅多型机制,但其研究成果能够引领未来对昆虫翅多型机制的探索研究,并加深人们对昆虫翅及组织可塑性发育与进化的理解.

[目的]本研究旨在揭示黑蚱蝉Cryptotympana atrata胚胎期的发育过程和共生菌在胚胎中的分布,确定若虫龄期数,明晰相关器官的形态发生过程以及若虫的形态变化(分化)与生境和寄主植物营养条件的相关性.[方法]通过野外采集和实验室人工饲养获得黑蚱蝉各发育阶段样本,采用光学显微镜和电子显微镜观察胚胎的发育,测量、分析不同龄期若虫的形态变化.[结果]黑蚱蝉的卵为长条形,表面具网状纹饰,卵孔位于距后极约1/4处.在胚胎发育初期,共生细菌Candidatus Sulcia muelleri(Sulcia)和类酵母共生真菌(yeast-like fungal symbionts,YLS)在卵的后极呈球状聚集;胚胎发育至约72 h后,新形成的胚带逐渐陷入卵黄中发育,共生菌球逐渐移动至前极,并进入附近宿主细胞;腹部分节后,共生菌球定殖于第6-8腹节背侧.发育至约第55天时进入滞育状态越冬,滞育期约为130 d.在胚胎发育早期,上唇节附肢从基部逐渐愈合,并与前唇基愈合形成复合结构.上颚节附肢不断延伸,形成上颚口针;下颚节附肢在胚胎发育早期即分化为外侧和内侧两个凸起,随后分别发育为近端的下颚板(后来又逐渐消失)和远端的口针.下唇节附肢在胚胎发育早期成对存在,之后愈合为一体,发育为喙管.发育至约第200天时,在第1腹节两侧出现胚足带,但发育至约第210天时随着胚胎翻转而逐渐退化.前若虫头部无齿突,胸、腹部具大量齿突,有助虫体破壳孵化;发育至约第245天时,一些胚胎开始孵化.若虫有5个龄期,各龄期除虫体不断增长外,复眼、触角、翅芽、胸足、生殖节等发生一系列形态变化,尤其是3对胸足的形态和功能分化最为显著.中足和后足细长,适于支撑和平衡身体;前足粗壮,腿节宽扁并逐渐形成齿梳,胫节镰刀状,具端齿、副齿和中叶,适于挖掘隧洞和固定于植物根系上取食.此外,1-4龄若虫均出现腹部膨大(Ⅰ型)和不膨大(Ⅱ型)两种类型个体,但5龄若虫无明显形态分化;以长势旺盛寄主植物柳树Salix babylonica和紫花苜蓿Medicago sativa为食的1龄若虫腹部形态分化早,以长势较差寄主为食的1龄若虫形态分化较迟,腹部不膨大个体比膨大个体进入2龄更早,且进入2龄后最初均为不膨大型个体.[结论]在黑蚱蝉胚胎发育过程中,由Sulcia和YLS组成的共生菌球从卵的后极移动至前极,最后定殖于第6-8腹节;上颚口针为基颚突起源,下颚口针为端颚突起源;黑蚱蝉若虫具5个龄期,幼期阶段的形态(功能)特化与其长期在地下隐蔽生活及羽化后的生态位转变密切相关,并与寄主植物的营养供给条件相关.

青藏高原东缘地区作为高原横向扩展的前缘过渡带,地理环境与气候条件多样,是全球生物多样性研究的一个热点地区.蝉科昆虫长期在地下营固定生活,成虫发生期短、体型硕大、飞行能力弱而难以扩散,因此适合多尺度的生物地理学和物种多样性研究;但青藏高原东缘地区的蝉科昆虫区系一直缺乏研究.本研究在区系调查和系统分类研究基础上,对青藏高原东缘地区的蝉科昆虫多样性及地理分布格局进行了研究.结果表明,该地区共分布蝉科昆虫3亚科46属100种(包括2个新纪录种),分别占中国已知属、种数量的59.7％和29.1％;区系以东洋界成分为主(73种,73.0％),古北界和东洋界共有成分次之(21种,21.0％),特有成分比例较高(19种,19.0％).该地区的10个亚区可被分为南、北2个大区,大致以秦岭及甘南山地为界.北段的黄土高原过渡区(MX+HB)、藏北过渡区(QZ)属于古北界,物种多样性较低,分布的主要是体型较小的姬蝉亚科物种.南段的东洋界各亚区由秦岭西段山地过渡区(HZⅠ+XNⅠ)、川西盆地及滇北过渡区(HZⅡ+XNⅣ)、青藏高原东南部的横断山脉"高原-山地"过渡区(XNⅡ+XNⅢ)及滇西山地过渡区(HN)组成.各亚区的物种多样性由北向南逐渐增多,四川盆地西部和横断山南部为多样性中心.在南段的各亚区中,西南亚区Ⅰ(XNⅠ)和华中亚区Ⅰ(HZⅠ)区系相似性最高,华中亚区Ⅱ(HZⅡ)和西南亚区Ⅳ(XNⅣ)区系相似性最高,它们分别聚合后再与"西南亚区Ⅱ+西南亚区Ⅲ(XNⅡ+XNⅢ)"聚合,最后与滇西的华南亚区(HN)聚合,表明滇西的华南亚区(HN)及高原东南部的横断山脉"高原-山地"过渡带(XNⅡ、XNⅢ)区系相对独特.蝉科同一类群的不同物种在该地区呈现出明显的生态位分化,分别向"低山-峡谷-丘陵"生境和"亚高山-高山"生境发展."低山-峡谷-丘陵"分布的适热物种分布区比较广泛,均在相邻的东部、南部地区有所分布;"亚高山-高山"的适冷种类则多局限分布于高海拔地带(许多都是特有种),尤其在横断山脉地区基本都呈现为小范围的斑块或点状分布,即"天空岛"分布格局.整体而言,青藏高原东缘南段的高大山体、相关地带的急剧下降地形及气候差异等对蝉科物种的扩散和分布影响更大,研究结果为青藏高原邻近地区的动物地理区划及生物多样性分化研究提供了新的信息和参考依据.

跨膜p24(transmembrane emp24 domain,TMED)基因与哺乳动物的免疫反应、信号传导、生长发育和疾病发展等密切相关.然而,昆虫中仅有果蝇TMED的报道.本研究从基因组鉴定了家蚕、赤拟谷盗、烟草天蛾和意大利蜂的TMED家族基因,并发现 1 个α类、1 个β类、1 个δ类和多个γ类的TMED家族基因成员构成模式产生于膜翅目分化前昆虫的共同祖先,而果蝇类TMED家族成员构成在进化中形成了独特模式.昆虫 TMED 家族 γ 类基因进化速度较快,分化成了TMED6-like、TMED5-like和TMED3-like这 3 个独立的亚类.TMED5-like基因在膜翅目昆虫发生了丢失,在鳞翅目昆虫祖先中发生了复制,在果蝇类发生了重复.昆虫TMED蛋白除具有典型的TMED结构特征外,还有明显的信号肽.家蚕 7 个TMED基因分布在 6 条染色体上,1 个基因为单外显子,6个基因为多外显子.从幼虫组织克隆了家蚕 7个TMED基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)全序列并登录到GenBank数据库.BmTMED1、BmTMED2和BmTMED6在家蚕各个时期和组织中均表达,所有基因都在家蚕 4 龄、5 龄和丝腺组织中表达.本研究发现了昆虫的TMED家族成员构成模式、γ类分化特点以及它们的进化历史等,为进一步研究家蚕以及其他昆虫TMED基因提供了基础.

目的 探讨Chir99021 对大鼠牙髓干细胞(DPSCs)成骨诱导分化的影响及机制.方法 原代分离大鼠DPSCs,利用荧光免疫法进行验证.设置不同浓度的Chir99021,通过CCK-8 检测细胞增殖情况挑选最适浓度.利用茜素红染色验证细胞成骨诱导分化.最后通过Real-time PCR、Western blotting检测成骨诱导分化相关基因与蛋白无翅型MMTV整合位点家族成员 1(Wnt1)、无翅型 MMTV 整合位点家族成员 3A(Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、轴抑制蛋白2 抗体(Axin2)、骨钙素(OCN)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的mRNA和蛋白表达情况.结果 牙本质涎磷蛋白(DSPP)和干细胞标记物波形蛋白(vimentin)阳性表达,说明大鼠 DPSCs 分离成功.大鼠DPSCs成骨诱导后钙沉积物显著上升,加入糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的小分子抑制剂Chir99021 后钙沉积物明显减少.大鼠 DPSCs 成骨诱导分化后 Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN 和 DMP1 表达明显上升,而加入Chir99021 后Wnt1、Wnt3a、β-catenin、Axin2、OCN和DMP1 蛋白表达均显著下降.结论 Chir99021 对诱导 7d后的大鼠DPSCs成骨诱导分化有一定的抑制作用.

鸡鸣散是一种传统古方,临床用于心力衰竭的治疗有较好疗效,但其机制缺乏进一步探讨.该研究采用小鼠冠状动脉结扎模型,评估其对心肌梗死小鼠心肌纤维化的影响及作用机制.拟采用冠状动脉左前降支结扎的方法构建心肌梗死后心力衰竭小鼠模型,通过超声影像图检测、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色及天狼猩红染色、血清心肌酶谱检测等多角度对鸡鸣散的药效进行评价;基于Western blot法对心室重构的关键蛋白转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、无翅型 MMTV 整合位点家族成员 3a(wingless-type MMTV integration site family member 3a,Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)、基质金属蛋白酶 2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶 3(matrix metallopeptidase 3,MMP3)、TIMP金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP metallopeptidase inhibitor 1,TIMP1)和TIMP金属蛋白酶抑制剂2(TIMP metallopeptidase inhibitor 2,TIMP2)进行检测.结果显示,与模型组相比,鸡鸣散高、低剂量组小鼠左心室收缩末内径(left ventricular intemal diameter in systole,LVID;s)和舒张末内径(left ventricular intemal diameter in diastole,LVID;d)均显著降低,左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)明显提高,心肌梗死后小鼠心脏功能有效改善;可有效降低心肌梗死后心肌损伤标志物如肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的水平,保护缺血心肌;HE染色显示,鸡鸣散可减弱心肌梗死后心肌炎症细胞浸润;Masson染色和天狼猩红染色显示,鸡鸣散能够有效抑制心肌纤维化水平,降低心肌组织中胶原Ⅰ/Ⅲ的含量比,改善心肌梗死后胶原重构.Western blot结果显示,鸡鸣散可降低TGF-β1、α-SMA、Wnt3a和β-catenin蛋白表达,降低MMP2、MMP3 和TIMP2 蛋白表达,提高TIMP1 蛋白表达,提示其通过干预心脏成纤维细胞转分化来源、心肌细胞外基质代谢降低胶原Ⅰ和α-SMA含量,发挥抗心肌梗死后心肌纤维化的作用.该研究揭示了鸡鸣散通过改善心室重构发挥治疗心肌梗死的作用,为后续探究鸡鸣散物质药效研究铺路.

目的:观察微小RNA(miRNA)-148a-3p对人牙髓干细胞(DPSCs)增殖活力及成骨分化的影响,并探讨可能机制.方法:取对数期DPSCs,分为空白组、NC组、inhibitor组、inhibitor+XAV939[无翅型MMTV整合位点家族蛋白(Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂]组.空白组不处理,NC组转染阴性对照质粒miR-148a-3p NC,inhibitor组转染miR-148a-3p inhibitor,inhibitor+XAV939组转染miR-148a-3p inhibitor并加入XAV939(40 μmol/L).转染48 h后qRT-PCR法检测miR-148a-3p表达量;MTT法检测增殖活力;ELISA法检测碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法检测矿化能力;双荧光素酶实验验证miR-148a-3p靶向基因;Western blot法检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-catenin、Runt相关转录因子2(Runx2)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP-1)以及Wnt1蛋白相对表达量.结果:与空白组、NC组比较,inhibitor组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量降低,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1 以及 Wnt1 蛋白表达量升高(P＜0.05);与 inhibitor组比较,inhibitor+XAV939组24 h、48 h、72 h吸光度值,GSK-3β蛋白表达量升高,ALP活性值,矿化结节面积占比,β-catenin、Runx2、DSPP、DMP-1以及Wnt1蛋白表达量降低(P＜0.05).结论:抑制miR-148a-3p表达可提升DPSCs增殖活力并促进其成骨分化,推测其作用机制与负向调控下游的靶基因Wnt1有关.