目的:探讨基于软骨脱细胞外基质微载体体外构建具有功能化和自我更新能力的软骨类器官。方法:取新鲜的猪关节软骨，将部分仅粉碎处理的软骨微粒设置为天然软骨组；利用物理离心化学萃取相结合的脱细胞方法，制备粒径合适的细胞外基质（ECM）微载体，设置为微载体组。通过旋转式生物反应器将人脐带干间充质干细胞（hUCMSCs）和人软骨细胞（hCho）按照3∶1的比例与微载体负载，体外构建软骨类器官，将诱导不同时间的类器官分为诱导0、7、14及21 d组。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色观察、DNA定量评估微载体组和天然软骨组细胞残留情况；番红O、甲苯胺蓝染色观察微载体ECM保留情况，二甲氨基苯甲醛比色法测定微载体组和天然软骨组胶原蛋白含量；二甲基亚甲蓝（DMMB）比色法测定微载体组和天然软骨组糖胺聚糖（GAGs）含量。扫描电镜及能谱分析对微载体进行进一步表征；将添加体积分数10%胎牛血清（FBS）的杜尔伯克改良伊戈尔低糖培养基（DMEM）培养的hUCMSCs作为对照组，将微载体浸提液培养的hUCMSCs作为实验组，两组分别设置培养1、3、5 d共3个时间点的亚组，细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）检测两组生物相容性。活死染色检测诱导0、7、14及21 d组的软骨类器官细胞活性，Ki67荧光染色鉴定诱导14 d软骨类器官的自我更新能力。RT-PCR测定诱导7、14、21 d组的软骨类器官，包括软骨形成相关标记物聚蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型胶原（COL2A1）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9）及软骨肥大、矿化相关标记物Ⅰ型胶原（COL1A1）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达水平；比色法和DMMB法测定诱导0、7、14及21 d组的类器官分泌胶原蛋白和GAGs能力。结果:DAPI荧光染色结果显示，天然软骨组具有大量细胞核，而微载体组则基本无细胞核。微载体组DNA含量为（7.8±1.8）ng/mg，较天然软骨组的（526.7±14.7）ng/mg显著降低（ P<0.01）。番红O、甲苯胺蓝染色可见微载体着色较深且均一，保留大量软骨ECM成分。微载体组胶原蛋白含量为（252.9±1.4）μg/mg，GAGs含量为（173.4±0.8）μg/mg，均显著低于天然软骨组的（311.9±2.2）μg/mg、（241.3±0.7）μg/mg（ P<0.01）。扫描电镜显示，微载体表面有凹凸不平相互交错的胶原纤维网络。能谱分析结果显示，C、O、N元素均匀分布在微载体，表明该微载体成分组成均匀。微载体生物相容性良好，培养1、3 d时，对照组和实验组CCK-8实验结果比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培养5 d，实验组 A值为0.53±0.02，优于对照组的0.44±0.03（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组中，hUCMSCs和hCho贴附在微载体表面且细胞活性好，活死比例分别为（70.6±1.1）%、（80.5±0.6）%、（94.5±0.9）%、（90.8±0.5）%（ P<0.01）；诱导14 d时，软骨类器官有大量Ki67阳性细胞。RT-PCR显示，诱导7 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为1.00±0.09、1.00±0.24、1.00±0.18、1.00±0.03、1.00±0.06、1.00±0.13；诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为4.16±0.28、5.09±1.25、5.65±1.05、0.47±0.01、1.68±0.02、0.21±0.06；诱导21 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为13.42±0.92、3.07±0.21、1.84±1.08、2.72±0.17、2.91±0.18、3.32±1.20。与诱导7 d组比较，诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、RUNX2表达水平均升高（ P<0.05），COL1A1表达水平降低（ P<0.05），OCN表达水平差异无统计学意义（ P>0.05）；与诱导7 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2表达水平均显著升高（ P<0.01），COL2A1、SOX9、OCN表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）；与诱导14 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平均升高（ P<0.05或0.01），COL2A1表达水平差异无统计学意义（ P>0.05），SOX9表达水平降低（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组胶原蛋白含量分别为（219.15±0.48）μg/mg、（264.07±1.58）μg/mg、（270.83±0.84）μg/mg、（280.01±0.48）μg/mg，GAGs含量分别为（171.18±1.09）μg/mg、（184.06±1.37）μg/mg、（241.08±0.84）μg/mg、（201.14±0.17）μg/mg。与诱导0 d组比较，诱导7、14、21 d组胶原蛋白和GAGs含量均显著升高（ P<0.01）。在诱导7、14、21 d组中，诱导7 d组胶原蛋白含量最低（ P<0.01），诱导21 d组胶原蛋白含量最高（ P<0.01）；诱导7 d组GAGs含量最低（ P<0.01），诱导14 d组GAGs含量最高（ P<0.01）。 结论:物理化学方法结合制备的微载体脱细胞成功，其基质保留较多，成分均一且无细胞毒性。基于微载体负载hUCMSCs与hCho体外成功构建软骨类器官，具有细胞活性好、自我更新能力、软骨形成相关基因表达强及分泌胶原蛋白和GAGs等特点，诱导14 d时构建的软骨类器官成软骨活性最佳。

目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:探讨SD鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体(Exos)修复骺板缺损的相关机制。方法:通过超离心提取鼠BMSCs来源的Exos，制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)负载的Exos(PLGA-Exos)支架，扫描电镜对支架进行表征。提取鼠软骨细胞，探究PLGA-Exos/RAW264.7细胞/软骨细胞共培养体系中巨噬细胞及软骨细胞相关基因的表达。将24只SD大鼠随机均分为A、B、C 3组，构建胫骨近端骺板缺损模型，将PLGA负载的BMSCs-Exos缓释棒(A组)及无Exos负载的PLGA棒(B组)分别填塞于骺板缺损区，C组为对照组(无填塞)。术后6周获取鼠胫骨标本，通过影像学X线分析、苏木精-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及巨噬细胞表型蛋白[M1型：诱导型一氧化氮合酶(iNOS)；M2型：Arg-1]染色，评估骺板缺损的修复效果。两组间比较采用独立样本 t检验。 结果:PLGAs支架为三维多孔结构，孔隙分布均匀，具有较高的连通性。Exos被成功加载至PLGA中。PCR结果发现，在炎症微环境中，与对照组比较，BMSCs-Exos调控巨噬细胞高表达M2表型蛋白Arg-1(7.12±1.01比1.00±0.03， t＝10.47， P<0.01)，且促进软骨细胞COL-2及Sox9基因mRNA表达(8.25±0.74比1.00±0.12， t＝16.84， P<0.01；4.64±0.16比1.00±0.01， t＝38.64， P<0.01)。术后6周胫骨标本影像学及组织学分析显示，A组骺板缺损区可见结构致密、与正常骺板结构及功能相似新生透明软骨组织，B组骺板缺损区新生组织由大量的纤维组织及少量的透明软骨组成，C组骺板缺损区骨桥形成。骺板损伤区巨噬细胞相关的表型蛋白免疫组织化学染色显示，A组M2型巨噬细胞表型蛋白Arg-1染色呈阳性显色反应，M1型巨噬细胞表型蛋白iNOS染色为阴性；B组少量细胞质基质被Arg-1抗体染为弱阳性，iNOS染色为阴性；C组Arg-1抗体染色为阴性，而iNOS染色呈阳性反应。 结论:在炎症微环境中，BMSCs-Exos调控巨噬细胞向M2型编程，促进骺板缺损修复。

肝脏储备功能是指肝脏受损后机体维持肝脏机能的代偿能力，对肝恶性肿瘤病损切除术有重要的临床参考意义。核医学肝胆功能显像技术可以定量评估肝脏血流灌注，在肝脏储备功能的评估、术后并发症的预测方面具有一定的优势。 99Tc m-半乳糖人血清白蛋白(GSA)和 99Tc m-甲溴苯宁(mebrofenin)是评估肝脏储备功能常用的显像剂，该文就其在肝脏储备功能评估的应用及进展进行综述。

目的 探讨香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对破骨细胞体积及整合素αvβ3 基因表达的影响.方法 首先制作CSE溶液,实验采用 7周龄C57BL/6J小鼠骨髓单个核细胞加入M-CSF和RANKL诱导生成破骨细胞,将浓度为 5%的CSE加入实验组破骨细胞作用 3 d,对照组不加入CSE.通过Trap染色识别对照组和实验组破骨细胞并于光镜下采图;通过甲苯胺蓝染色识别两组破骨细胞在骨片上形成的骨陷窝并于光镜下采图,均用NIH imageJ计算数量及面积.用实时荧光定量聚合酶链反应,以GAPDH作为内参,最后通过2-ΔΔCT计算,以检测Trap、CTR以及整合素αvβ3 mRNA表达水平.通过Western blot检测整合素αvβ3蛋白表达.结果 破骨细胞表面积及细胞核数量的计量表明,实验组诱导形成的破骨细胞显著大于对照组(P<0.01).实验组骨片上吸收陷窝数量及面积明显多于对照组(P<0.05),CSE处理组的TRAP mRNA水平为 1.16±0.13,明显高于对照组(P<0.05),CTRmRNA水平为 0.38±0.04,明显低于对照组(P<0.01).CSE处理组的整合素αvβ3 mRNA水平为 1.75±0.05,显著高于对照组(P<0.01),蛋白质印迹分析结果也明显高于对照组(P<0.05).结论 CSE能显著增加破骨细胞的体积并上调整合素αvβ3的基因表达,并可能对骨吸收有促进作用.

[目的]探索骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与纳米聚乳酸羟基乙酸(polyaiticgly-colic Acid,PLGA)复合物修复大鼠股骨软骨缺损的效果.[方法]从大鼠胫骨和股骨骨髓腔内获取BMSCs并培养传代,之后培养到纳米PLGA支架材料上,进行电镜下观察.将SD大鼠的双后肢进行手术制造股骨远端软骨缺损,右侧缺损填充BMSC-PLGA复合材料(移植组),而左侧缺损不再做任何处理(空白对照组).于术后1个月和3个月进行大体观察评分和组织学评分,测定并比较两组甲苯胺蓝染色和免疫组化染色光密度值.[结果]BMSCs呈特有的螺旋状生长,PLGA电镜下呈纤维交织网状结构,BMSCs在材料上生长良好.植入体内后1、3个月移植组大体观察评分[(8.1±0.8)vs(1.7±0.8),P＜0.001;(10.3±1.2)vs(3.8±1.5),P＜0.001]、组织学评分[(11.6±1.0)vs(4.0±0.9),P＜0.001;(15.5±1.0)vs(4.8±0.8),P＜0.00l]、甲苯胺蓝染色 OD 值[(0.2±0.0)vs(0.l±0.0),P＜0.001;(0.4±0.0)vs(0.1±0.0),P＜0.001],术后 3 个月免疫组化 Ⅱ 胶原检测 OD 值[(0.4±0.0)vs(0.1±0.0),P＜0.001 均显著优于空白组.[结论]LGA结合BMSCs有效修复了大鼠软骨缺损,为软骨缺损治疗展示了可能的组织工程修改方法.

目的 研究姜黄素对关节软骨细胞损伤的保护作用,以及对转化生长因子(TGF)-β1/Smad2通路的影响.方法 选取6周龄SD雌性大鼠,脱颈椎处死后分离获取膝关节软骨细胞,甲苯胺蓝染色进行细胞鉴定.将细胞分为空白对照组、模型组以及姜黄素干预组(低、中、高剂量),其中模型组以及姜黄素干预组用5 μg/L脂多糖预处理1 h,干预组(低、中、高剂量)加入含5、15、50 μmol/L姜黄素的培养基,空白对照组、模型组加入不含姜黄素的培养基.培养24 h,采用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡情况,采用蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9)、软骨细胞外基质蛋白(Aggrecan、COLL2)以及TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白(TGF-β1、Smad2/3、Smad7)表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测TGF-β1/Smad2信号通路基因表达情况.结果 模型组凋亡小体减少,细胞核固缩深染,姜黄素干预组随着浓度增加,凋亡小体较模型组呈逐渐降低趋势.5组细胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9)表达水平差异有统计学意义(F=30.382,17.362,39.284,18.855;P均＜0.05),其中姜黄素干预组Bax、caspase-3、caspase-9高于空白对照组,低于模型组,而干预组Bcl-2低于空白对照组,高于模型组;5组细胞软骨细胞外基质蛋白(Aggrecan、COLL2)表达水平差异有统计学意义(F=26.605,40.699;P均＜0.05),其中姜黄素干预组Aggrecan、COLL2高于空白对照组,模型组低于空白对照组,细胞外基质蛋白以及凋亡蛋白表达水平呈剂量依赖(P＜0.05).5组细胞TGF-β1/Smad信号蛋白、基因(TGF-β1、Smad2/3、Smad7)表达水平差异有统计学意义(F=27.667,13.684,26.029,61.032,25.877,35.934;P均＜0.05),其中姜黄素干预组 TGF-β1、Smad2/3 高于空白对照组、模型组,而Smad7低于空白对照组、模型组,TGF-β1/Smad信号通路蛋白、基因表达水平呈剂量依赖(P＜0.05).结论 姜黄素可改善脂多糖诱导的软骨细胞炎性损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞外基质合成,其作用机制可能与激活TGF-β1/Smad2通路有关.

目的 建立一种血液肿瘤BCL-2抗凋亡蛋白抑制剂药敏筛选的简易BH3分析法.方法 建立基于显微镜和JC-1染色的BH3分析方法,通过BH3-only模拟肽描绘K562、NB4细胞系BCL-2家族抗凋亡蛋白依赖谱,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)加以验证;回溯临床治疗疗效,检验该方法对临床样本BH3药敏分析结果的符合情况.结果 BH3分析结果显示NB4对抗凋亡蛋白的依赖程度依次为BCL2＞MC1-1＞BCL-XL;K562的依赖程度依次为BCL-XL＞MC1-1＞BCL2.PCR分析BCL-2家族基因表达量显示,K562抗凋亡蛋白MCL-1、BCL2、BCL-XL相对表达程度较高,BH3-only促凋亡蛋白中BIM、PUMA、NOXA高表达而HRK低表达,细胞抗凋亡能力更依赖于BCL-XL;NB4抗凋亡蛋白BCL-XL表达明显低于MCL-1与BCL-2,BH3-only促凋亡蛋白NOXA低表达,细胞抗凋亡更依赖于MCL-1与BCL-2而非BCL-XL,与BH3分析结果相符.对连续6例血液肿瘤患者骨髓进行BH3分析,结果显示 6例患者均对HRK(BCL-XL抑制物)、VEN(BCL-2抑制物)不敏感;4例患者(例 1～3,例 5)对NOXA(MCL-1抑制物)表现为敏感,2例(例 4、例 6)的敏感度较低(＜50%).药敏预测结果显示 6例患者均对BCL-2抑制剂耐药,例 1～3、例 5患者对MCL1抑制剂敏感,例 4和例 6对MCL1抑制剂可能耐药.回溯临床用药效果(4～6个疗程)显示例 1～5患者对BCL-2抑制剂相关方案治疗无效,考虑与BCL-2抑制剂不敏感有关,例 5更换西达苯胺治疗有效,例 4和例 6患者西达苯胺相关方案疗效不佳,考虑与MCL-1抑制物不敏感有关,上述临床结局与BH3预测结果一致.结论 基于荧光显微镜和JC-1染色的BH3分析是简便可行的,可用于检测血液肿瘤细胞对不同抗凋亡蛋白的依赖性,从而为BCL-2家族相关抑制剂的选择提供证据.

目的 考察不同有机溶剂纯化对聚苯胺(polyaniline,PANI)纳米材料生物相容性的影响,为开发新型高分子医用材料奠定基础.方法 分别利用二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)对化学氧化法合成的PANI纳米线进行纯化处理,比较纯化前后材料的微观形态变化;将纯化前后的PANI材料配制成100％、50％、25％、10％、5％和1％的浸提液,以BV2细胞为研究对象,采用CCK-8法测定各浸提液组的细胞存活率;将纯化前后的PANI材料配制成100、80、64、51和41 mg·mL-1的混悬液,通过灌胃给药考察材料对小鼠口服急性毒性及对肝肾的损伤.结果 所得材料为直径约20 nm的PANI纳米线,经过纯化后其形貌未发生明显改变.未经纯化的100％PANI浸提液具有很强的细胞毒性,但是随着浓度的降低,其毒性逐渐减弱.经DMF和DMSO纯化后,细胞在其浸提液中的存活率均高于同浓度下未纯化材料(P均＜0.01).PANI材料用DMSO纯化后给药,各组小鼠的体质量增长率高于未纯化材料(P＜0.05或P＜0.01),其最大耐受量(MTD)＞3 000 mg·kg-1.解剖后,各组小鼠肾脏无明显变化,但是肝细胞受到不同程度的损伤,材料经纯化后的损伤效应低于未纯化材料.结论 溶剂处理是一种简便可行的PANI纳米材料纯化策略,可在提高材料生物相容性的同时维持其形貌不变.

目的 研究日本血吸虫感染对小鼠肝脏铁分布及铁蛋白表达的影响.方法 24只昆明小鼠随机分为对照组、感染6、8、10周组,每组6只.感染组经腹部皮肤接种尾蚴(20±2)只,待小鼠染虫6、8、10周时,处死小鼠留取肝脏,采用苏木精-伊红(HE)染色和马松(Masson)染色观察小鼠肝脏病理变化,采用二氨基联苯胺(DAB)增强的普鲁士蓝(Perl's)铁染色观察肝组织铁分布,采用免疫组织化学染色检测肝脏铁蛋白的表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测小鼠肝脏铁蛋白轻链和重链mRNA的表达.结果 与对照组小鼠比较,血吸虫感染6、8、10周组小鼠肝脏颜色逐渐变深,质地逐渐变硬.HE和Masson染色显示,感染组小鼠肝组织内有虫卵沉积,围绕虫卵形成肉芽肿及纤维化,而对照组未出现虫卵肉芽肿.DAB增强的Perl's铁染色显示,与对照组比较,感染6、8、10周组肝细胞铁染色强度降低,差异均有统计学意义(t=5.94、7.72、9.67,P均＜0.05),肝血窦内有铁色素沉积,且随感染时间延长逐渐增多(t=3.89、8.59、12.50,P均＜0.05),虫卵壳铁染色较强.免疫组织化学染色显示,感染6、8、10周组的肝脏铁蛋白表达均低于对照组(t=5.59、7.35、9.66,P均＜0.05),且随着感染时间延长逐渐减少.RT-qPCR结果显示,感染6、8、10周组的铁蛋白轻链和重链mRNA表达水平均低于对照组(t轻链=4.01、7.21、9.97,t重链=4.50、5.23、5.22,P均＜0.05).铁蛋白轻链mRNA随着感染时间的延长逐渐减少,与感染6周组比较,感染8周、10周组差异均有统计学意义(t=3.20、5.96,P均＜0.05).重链mRNA随着感染时间的延长无明显变化,感染6、8、10周组间差异均无统计学意义(t=0.73、0.72、0.01,P均＞0.05).结论 日本血吸虫感染可导致小鼠肝细胞铁含量减少,铁蛋白表达降低,这间接反映了血吸虫感染导致机体缺铁的状态,是血吸虫感染所致贫血的机制之一.