[目的]肠出血性大肠杆菌O157∶H7是世界范围内重要的动物源性致病菌之—,可感染人.Ⅰ型菌毛是多种致病性大肠杆菌(如肾盂肾炎型大肠杆菌等)可表达的一种黏附结构,与细菌吸附黏膜表面密切相关.然而,O157∶H7 fim操纵子上几个核苷酸的缺失却导致其不能表达Ⅰ型菌毛.BLAST比对结果表明O157∶H7独有的开放阅读框z3276编码的氨基酸序列与其他大肠杆菌Ⅰ型菌毛高度同源,这可能是对O157∶H7不能表达Ⅰ型菌毛的补偿机制,但确切功能尚不清楚.本文探究z3276基因的生物学功能.[方法]利用O157∶H7 86-24参考菌株构建z3276基因缺失株(△z3276),并构建其互补株(C△z3276),进而比较亲本株、△z3276与C△z3276的生物学特性及对小鼠致病性差异.[结果]与亲本株相比,△z3276进入对数生长期的时间延后,在半固体琼脂平板上的迁移直径明显缩小,生物被膜形成能力显著减弱.△z3276对HEp-2细胞的黏附和侵袭能力并无明显变化,但对IPEC-J2细胞的侵袭能力明显减弱.在小鼠攻毒试验中,△z3276组排菌数量减少、排菌持续时间缩短.C△z3276各项特性均能回复到与亲本株一致的水平.[结论]z3276基因可能是O157∶H7重要的毒力相关因子.

许多革兰氏阴性茵借助Ⅲ型分泌系统黏附在宿主细胞表面,然后跨越胞膜将特异性蛋白注入宿主细胞内,破坏宿主细胞内的多种信号通路,从而有利于细菌的感染及定殖.在肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)中,除了肠细胞脱落位点(Locus of entericyte effacement,LEE)毒力岛编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)外,在分析肠出血性大肠杆菌O157∶H7的基因组序列时发现一个新的Ⅲ型分泌系统,大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2(Escherichia coli type Ⅲ secretion system 2,ETT2)毒力岛.研究显示,ETT2可能在大多数菌株中不具有完整的分泌系统功能,但是其对于细菌毒力的发挥具有重要作用.因此,本文简要综述了大肠杆菌ETT2的基因特征、ETT2的分布与流行、ETT2的功能与机制等方面的主要研究进展.

目的 分析上海市首例由腹泻综合监测系统报告的肠出血性大肠杆菌(E.coli)O157∶H7感染性腹泻病例的发现过程及流行病学特征,为防制O157∶H7感染提供依据.方法 收集病例的流行病调查资料及临床病史,结合实验室检查结果和历史监测数据进行描述性分析.结果 2013-2015年上海市腹泻综合监测点累计采样8 441例,未检出肠出血性大肠杆菌.2016年6月首次由腹泻患者粪便标本中,检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7产毒株,采集密切接触者共8份粪便标本和环节样本3份,均未检出O157∶H7.结论 本起E.coli O157∶H7感染散发疫情由腹泻综合监测系统发现,应强化腹泻综合监测系统的作用,及时发现传染源,有效控制肠道传染病传播风险.

目的 将叠氮溴化乙锭(EMA)与双重荧光PCR技术结合,建立EMA荧光PCR方法,快速检测食品中活性大肠杆菌O157∶H7.方法 在已建立大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的基础上,优化EMA作用浓度、时间;观察EMA对活菌扩增的影响;利用模拟样品和现行检测方法做比较.结果 30 μg/ml的EMA与细菌作用、曝光各15 min,可抑制4×106 CFU/ml O157∶H7死菌DNA的扩增;O157:H7活菌浓度＞4×105 CFU/ml时,EMA对活菌扩增有一定影响,离心可以降低其影响;活菌数/死菌数≥20％时,可以检出活菌;当活菌数量足够大时,死菌的存在不影响活菌的检出;EMA荧光PCR方法检测模拟样品,结果与现行的细菌分离培养金标准SN/T 0973-2010始终保持一致.结论 建立的EMA荧光PCR方法可准确鉴定活态大肠杆菌O157:H7,避免死菌DNA造成的假阳性,在食品检测中具有一定的应用价值.

[背景]大肠杆菌(Escherichia coli) O157∶H7是导致肠出血性大肠杆菌食源性疾病暴发的主要血清型,免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMBS)在E.coli O157的检测中发挥着重要作用,而免疫磁珠的稳定性、特异性、广谱性等性能指标关系着在实际应用中的使用效果.[目的]制备高效、稳定且具有广谱性的免疫磁珠,联合分子检测技术如环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术、PCR等,提高目标菌的检出率.[方法]采用新型的磁珠活化剂MIX&GO制备E.coli O157免疫磁珠,并进行广谱性以及特异性检测;针对6种试剂牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、酪蛋白(Casein)、海藻糖(Trehalose)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone,PVP)、抗坏血酸(Vitamin C)和防腐剂ProClin 300,利用正交试验L18(37)优化免疫磁珠保存液组分;采用IMBS-LAMP、IMBS-PCR、IMBS-生化、菌液-LAMP、菌液-PCR、显色平板-生化鉴定6种方式对20份生猪肉样品进行检测.[结果]利用MIX&GO活化剂制备的免疫磁珠捕获率最高达到81.5％±1.3％;免疫磁珠保存液最优配方为:牛血清白蛋白15.0 g/L,酪蛋白10.0 g/L,海藻糖10.0 g/L,PVP 2.0 g/L,抗坏血酸5.0 g/L,ProClin 300 2.5 g/L,保存6个月后免疫磁珠捕获率为75.5％;在20份生猪肉样品的检测中,自制磁珠和商品化磁珠与LAMP联用均检出9例阳性样品;IMBS-LAMP在6种检测方式中具有最高的检测灵敏度,但检出的样品会因磁珠抗体的差异而有所不同.[结论]与商品化磁珠相比,实验制备的免疫磁珠具有良好的特异性和广谱性,免疫磁珠-LAMP联用提高了目标菌的检出率,是一种高灵敏度、具有应用前景的检测方法.

目的 分析来自不同地区、具有不同遗传背景的献血浆者血浆抗体谱差异.方法 收集血型、年龄、性别相匹配的来自巴马长寿地区有家族长寿背景和无家族长寿背景的血浆以及某东部地区的血浆各22份、即为3个大组,共66份血浆标本.每大组设置2个生物学重复,共6个小组,每个小组均为11份血浆各50 μL等体积混合而成.以肠出血性大肠杆菌O157∶H7蛋白质组作为抗原库,利用蛋白质双向电泳技术和蛋白免疫印迹杂交技术获得不同血浆标本IgG的抗体谱,采用双向电泳图像分析软件进行差异分析.结果 通过建立的方法获得了较高质量的血浆标本IgG抗体谱,3组标本中的IgG分别识别198、190和149个大肠杆菌蛋白质点;巴马地区有家族长寿背景和无家族长寿背景的血浆标本IgG抗体谱未见明显差异;但二者与东部地区血浆标本IgG抗体谱相比差异较为明显,如识别抗原数量不同,目标抗原点分布也不同.结论 3组血浆标本均含有针对大肠杆菌O157∶H7的广谱抗体;来自同一地区的血浆标本IgG抗体谱较为一致,来自不同地区人群的血浆标本IgG抗体谱差异明显,提示生活环境及遗传背景可能会影响人血浆中针对外来抗原的抗体的种类与多样性.

目的 对一起外籍船舶船员感染性腹泻疫情进行病原学检测.方法 采集外籍船舶船员的粪便10份、肛拭子样本16份、血液9份、其他样品6份.依照《感染性腹泻诊断标准》(WS 271-2007)和《预防医学微生物学及检验技术》,通过细菌培养、核酸检测及毒力基因检测等方法来鉴定本起感染性腹泻疫情是否由O157∶H7引起.结果 从腹泻患者的肛拭子和粪便中,检出2份肠出血性大肠杆菌EHEC-stx1基因核酸阳性,患者血清中检出志贺毒素EHEC-stx1,并且从肛拭子和粪便中培养出2株肠出血性大肠杆菌菌株.结论 本次外籍船舶船员感染性腹泻是由肠出血性大肠杆菌引起,并排除本次感染性腹泻是由O157∶H7引起的疫情.

[背景]肠出血性大肠埃希菌O157∶H7是重要的食源性致病菌之一,并且其耐药性越来越严重,寻找裂解性强噬菌体用于防治大肠埃希菌感染具有广阔的应用前景.[目的]从环境中分离鉴定能特异裂解大肠埃希菌O157∶H7的噬菌体,通过对生物学特性及裂解细菌功效的探究,为其在食品安全防控中提供理论依据和研究基础.[方法]通过双层平板法分离并纯化噬菌体,透射电镜观察噬菌体形态,测定最佳感染复数、一步生长曲线、pH稳定性、温度稳定性,对噬菌体进行全基因组测序及噬菌体裂解细菌功效.[结果]2株大肠埃希菌O157∶H7噬菌体FEC14和FEC19的头部皆呈二十面体立体对称,FEC14头部直径约80 nm,尾丝呈星形,FEC19头部直径约58nm,尾丝呈针形;噬菌体FEC14的最佳感染复数为0.001,潜伏期为15 min,裂解期为65 min,平均暴发量为156PFU/cell,FEC19的最佳感染复数为0.1,潜伏期为10min,裂解期为80min,平均暴发量为800 PFU/cell;噬菌体FEC14能在60℃、pH 4.0-11.0条件下存活,噬菌体FEC19在 70℃、pH 5.0-9.0 条件下存活;FEC14 归类于有尾目(Caudovirales)Ackermannviridae 科Kuttervirus 属,FEC19 归类于有尾目(Caudovirales)肌尾科(Myoviridae)Wifcevirus 属;单一噬菌体或混合鸡尾酒法均能降低染菌牛肉中的细菌数量,并且未发现已知毒力基因和耐药基因,能控制大肠埃希菌O157∶H7的污染.[结论]2株大肠杆菌O157∶H7噬菌体FEC14和FEC19特异性高、稳定性强、裂解效率高,在控制食品中大肠埃希菌O157∶H7污染的应用中具有很大潜力,将来可以开发为食品防控制剂用于食品加工各个领域.

[背景]肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7和肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)O55∶H7是2株常见食源性致病菌,能导致腹泻及肠道外疾病,其特异性噬菌体具有制备新型抗菌制剂的应用前景.[目的]分离能特异裂解O157∶H7和O55∶H7的噬菌体,并分析其生物学特性和基因组特征,探索致病性大肠杆菌防控的抗生素替代方法.[方法]利用双层平板法从环境水样中分离噬菌体,对其形态、感染复数、宿主范围、一步曲线等生物学特性进行鉴定,使用Illumina MiSeq平台对其全基因组进行测序,利用RAST、Prokka、BLASTp等软件进行生物信息学分析.[结果]分别以E.coli O157∶H7和O55∶H7为宿主分离出2株特异性烈性噬菌体:vB_EcoM_P251和vB_EcoM_P255,均属于肌尾病毒科(Myoviridae).最佳感染复数均为1,在培养15 min内能以 91.9％和90.8％的速率吸附到宿主细胞上,而且在37-60℃、pH 4.0-11.0条件下保持高且稳定的活性;P251仅对大肠杆菌O157∶H7和O78∶H11菌株具有感染性,P255对O55∶H7、O157∶H7等11株不同血清型的EHEC和EPEC均具有感染性.P251基因组全长为136 254 bp,P255基因组全长为111 068 bp,GC含量分别为37％和35％;分别含有227、173个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中,80、73个ORF与已知功能基因具有显著相似性;P251还含有2个tRNA.比较基因组显示,P251和P255基因组在其48％的长度上共享72.24％的核苷酸同一性.[结论]分离鉴定了2株新的O157∶H7和O55∶H7噬菌体P251和P255,宿主范围广泛,具有防控食源性致病性大肠杆菌的潜力.

目的 重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7 4种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a.方法 设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性.结果 RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测.检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7的最低检测限为10copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应.应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000).结论 RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测.