目的 探讨茵陈水提物对多药耐药蛋白 3(MDR3)基因突变导致的新生儿肠外营养相关性胆汁淤积(PNAC)的保护作用及可能机制.方法 ①将人原代培养肝细胞应用体外细胞培养、CRISPR/Cas9 慢病毒感染、MDR3 突变基因导入等技术处理后,比较 1%脂肪乳诱导处理前(0)和处理后 16、32、48 h不同时间点肝细胞上清液中肝胆生化指标[丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(IBil)、总胆汁酸(TBA)]的水平,确定构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间.②将人原代培养肝细胞株按随机数字表法分为空白对照组、MDR3 基因野生型组、MDR3 基因突变组、茵陈水提物干预组.空白对照组只用培养液处理,MDR3 基因野生型组应用慢病毒感染融入野生型MDR3基因和培养液培养,MDR3 基因突变组应用慢病毒感染慢病毒导入MDR3(c.485T＞A、c.2793insA、c.1031G＞A、c.3347G＞A)突变基因和培养液培养,茵陈水提物干预组应用慢病毒感染导入MDR3 突变基因和培养液培养的基础上,加入 100 g/L茵陈水提物预处理,然后将 4 组肝细胞分别加入 1%脂肪乳诱导处理,处理时间为构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需时间.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定 4 组肝细胞上清液中肝胆生化(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组肝细胞编码MDR3、胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白(MRP)2～4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的三磷酸腺苷结合盒蛋白(ABCB4、ABCB11、ABCC2、ABCC3、ABCC4)和TNF基因mRNA的表达丰度.结果 与空白对照组和MDR3基因野生型组比较,MDR3基因突变组在经1%脂肪乳诱导处理前和处理后16h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平比较差异无统计学意义,经 1%脂肪乳诱导处理 32h和 48 h MDR3 基因突变组肝细胞上清液肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平均明显升高(均P＜0.05),确定构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间为 32 h.与MDR3 基因突变组比较,茵陈水提物干预组肝细胞在脂肪乳处理后 32h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、TBA)水平均明显降低[ALT(ng/L):148.3±2.3 比 164.9±7.0,AST(ng/L):2767.4±78.8 比 3239.4±107.1,TBil(μmol/L):7.6±0.2比13.6±0.3,DBil(μmol/L):1.8±0.1比5.7±0.2,TBA(μmol/L):3.4±0.2比6.7±0.1,均P＜0.05];空白对照组、MDR3 基因野生型组、MDR3 基因突变组和茵陈水提物干预组肝细胞编码MDR3、MRP2、MRP3、MRP4 的ABCB4、ABCC2、ABCC3、ABCC4 基因mRNA表达丰度差异无统计学意义;TNF基因mRNA在MDR3基因突变组呈高表达(2-??Ct:1.258±0.200比1.001±0.052),茵陈水提物干预组呈低表达(2-??Ct:0.387±0.247 比 1.258±0.200),组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).与MDR3 基因突变组比较,茵陈水提取物干预组肝细胞编码BSEP的ABCB11 基因mRNA的表达丰度明显增高(2-??Ct:2.955±0.479 比 1.333±0.529,P＜0.05).结论 茵陈水提物对MDR3 基因突变导致的PNAC有一定保护作用,可能与拮抗炎症反应,降低TNF基因的mRNA表达和改善编码BSEP的ABCB11 基因的mRNA表达有关.

报告1例垂体功能减退致婴儿胆汁淤积性肝病，探讨内分泌激素在胆汁淤积性肝病中的作用及发病机制。通过总结临床特征、实验室、病理及基因检测结果，就肝细胞胆管膜面相关转运蛋白研究其表达是否正常，发现婴儿胆汁淤积伴低血糖应警惕垂体功能减退，皮质激素可能通过下调胆盐输出泵功能致胆汁淤积的发生。

目的 探究中脑星形胶质细胞神经营养因子(mesen-cephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在利福平(rifampicin,RFP)诱导的胆汁淤积性肝损伤中的作用.方法 借助肝细胞MANF特异性敲除(hepatocyte-specific MANF knockout,HKO)小鼠模型,观察MANF基因缺失对RFP诱导的小鼠胆汁酸转运体表达的影响.体外观察MANF敲减后对人肝癌细胞HepG2的核因子红细胞系2相关因子2(nu-clear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的影响.结果 与野生型(wild type,WT)小鼠相比,RFP处理的WT小鼠的胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)以及多药耐药相关蛋白 4(multidrug resistance-associated protein 4,MRP4)的蛋白和基因表达水平增加.然而,与RFP处理的WT小鼠相比,HKO小鼠中BSEP、多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1,MDR1)、MRP2/3/4 和有机溶质转运蛋白 α(organic solute transporter α,OSTα)的蛋白和(或)基因表达水平明显降低.体外细胞MANF敲减会削弱RFP诱导的Nrf2的表达以及核内移.结论 MANF可能通过调节Nrf2的表达调控BAT的适应性表达,在RFP诱导的肝损伤中发挥保护作用.

目的 基于保肝活性优化大黄硝石汤组分配比,并进行药效评价.方法 采用Wistar大鼠,随机分为空白组、模型组、熊去氧胆酸组(阳性组)及大黄硝石汤组分正交配伍组,采用α-萘异硫氰酸酯诱导肝损伤动物模型,以肝功能生化为指标,并结合多元统计方法,优化大黄硝石汤组分配比.另取Wistar大鼠,在肝损伤动物模型基础上,以生物体征、肝功能生化为指标,优化大黄硝石汤组分中芒硝剂量(0、1、2、4 g).在此基础上,将Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、熊去氧胆酸组,栀柏黄组分小、中、大剂量组,通过生物体征、肝功能生化、脂质过氧化物,肝脏病理及胆汁转运相关指标等考察,评价栀柏黄组分保肝药效.结果 经正交、多元统计优化的大黄硝石汤组分能够改善肝损伤动物生物学体征及肝功能生化异常,含不同剂量芒硝的大黄硝石汤优化组分均能减缓肝损伤动物体质量减轻(P＜0.01或P＜0.05),降低血清肝功酶活性(P＜0.01或P＜0.05),且除碱性磷酸酶外,大黄硝石汤组分不同剂量芒硝组对肝功酶活性回调差异无统计学意义.综合考虑,将其组方优化为不加芒硝的栀柏黄组分.优化后的栀柏黄组分能改善肝损伤动物异常生物学体征,降低血清肝功酶活性(P＜0.01或P＜0.05)及总胆红素、三酰甘油水平(P＜0.05),回调肝脏脂质过氧化物水平(P＜0.01或P＜0.05),修复肝脏病理,回调胆盐输出泵(BSEP)等胆汁转运蛋白表达(P＜0.05),从而发挥较好保肝活性.结论 经正交、多元优化及单因素考察得到的大黄硝石汤栀柏黄组分具有改善动物异常生物体征、保肝降酶、抗脂质过氧化、回调异常代谢、修复肝脏病理等药效,这为其进一步临床应用及开发提供了参考.

目的 研究四逆散对Mdr2(Abcb4)基因缺陷(Mdr2-/-)小鼠胆汁淤积性肝纤维化的缓解作用,并探究其作用机制.方法 C57BL/6J小鼠作为对照组;C57BL/6J背景的Mdr2-/-小鼠作为模型小鼠,设模型组和四逆散低、高剂量(按生药量计为3.12、6.24 g·kg-1)组.四逆散组连续3周ig给予四逆散水提物,每天1次,对照组给予纯水.试剂盒法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆汁酸水平;取肝脏、脾脏称质量,计算肝脏、脾脏系数;结合小鼠肝组织HE染色,Masson染色,纤连蛋白(Fibronectin)、细胞角蛋白19(CK19)的免疫组化染色,明确四逆散对Mdr2-/-小鼠肝纤维化及胆汁淤积的影响.基于小鼠肝脏转录组学测序技术,挖掘四逆散改善Mdr2-/-小鼠肝损伤的作用靶点,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肝纤维化[fibronectin(Fn1)、胶原蛋白1(Col1a1)、角蛋白19(krt19)]、炎症[白细胞介素-1β(Il1β)、Il6、肿瘤坏死因子-α(Tnfα)、一氧化氮合成酶(Inos)]、细胞焦亡[凋亡相关斑点样蛋白(Pycard)、Il18]、胆汁酸合成[细胞色素P450家族成员7A1(Cyp7a1)]及转运[胆盐输出泵(Abcb11)、ATP结合盒转运蛋白(Abcc3)、钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(Slc10a1)]相关基因的转录水平.结果 与模型组比较,四逆散高剂量显著降低血清总胆汁酸的水平(P＜0.05);明显缓解了Mdr2-/-小鼠肝脏中央静脉及胆管周围炎性细胞的浸润和胶原纤维的沉积,并显著抑制胆管反应的发生.转录组学及qRT-PCR结果共同表明,四逆散下调Mdr2-/-小鼠肝脏纤维化、炎症、细胞焦亡相关基因的转录(P＜0.05);同时,四逆散下调胆汁酸合成关键限速酶调控基因Cyp7a1和调控胆汁酸向肝内转运的基因Slc10a1的转录,并上调调控胆汁酸外排的基因Abcb11、Abcc3的转录.结论 四逆散能缓解Mdr2-/-小鼠胆汁淤积性肝纤维化,机制可能与其调控炎症反应、细胞焦亡以及胆汁酸的合成和转运有关.

目的:探讨加味茵陈蒿汤治疗α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的胆汁淤积小鼠肝损伤的作用机制.方法:24只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(Normal组)、ANIT造模组(ANIT组)、加味茵陈蒿汤组(JWYCH组)、熊去氧胆酸组(UDCA组),每组6只.Normal组与ANIT组灌胃给予饮用水,持续10d;JWYCH组灌胃给予加味茵陈蒿颗粒剂水溶液,UDCA组灌胃给予熊去氧胆酸悬液,持续10d.第7天,小鼠用ANIT油溶液(50 mg/kg)造模.末次给药后,采用全自动生化仪检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)及总胆红素(TBiL)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态学变化;采用RT-qPCR检测肝组织法尼醇X受体(FXR)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、FGF受体4(FGFR4)mRNA表达;Western blot检测肝组织FGF15、FXR、磷酸化FXR(p-FXR)、FGFR4、外排型转运体[胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)]、摄取型转运体[钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)、有机阴离子转运多肽2(OATP2)]蛋白表达.结果:血清肝功能生化学指标显示,与 Normal 组相比,ANIT 组 ALT、ALP、AST、TBA、TBiL 水平明显升高(P＜0.05);JWYCH 组和 UDCA 组 ALT、ALP、AST、TBA、TBiL水平明显低于ANIT组(P＜0.05);与UDCA组相比,JWYCH组的TBA水平明显下降(P＜0.05).肝组织病理结果显示,光镜下ANIT组可见胆管内胆栓形成,其汇管区以及胆管周国可见大量炎性细胞浸润,提示造模成功;JWYCH组、UDCA组病理损伤较ANIT组有明显改善.Western blot结果显示,与Normal组比较,ANIT组FGF15、FXR、p-PXR、FGFR4、BSEP、MRP2蛋白表达均明显减少(P＜0.05),提示造模成功;与 ANIT组比较,JWYCH组和 UDCA 组 FGF15、FXR、p-PXR、FGFR4、BSEP、MRP2 蛋白表达明显增加(P＜0.05,P＜0.01),而 NTCP、OATP2表达明显减少(P＜0.05).RT-qPCR结果显示,与Normal组比较,ANIT组小鼠肝组织FXR、FGF15、FGFR4的mRNA表达明显降低(P＜0.05);与ANIT组比较,UDCA组和JWYCH组FXR、FGF15、FGFR4的mRNA表达明显增加(P＜0.05);与UDCA组相比较,JWYCH组FGF15、FGFR4的mRNA表达明显增加(P＜0.05).结论:加味茵陈蒿汤能降低总胆汁酸水平,改善胆汁淤积和肝组织损伤.其作用机制可能是通过上调肝细胞FGF15、FGFR4表达,上调FXR和p-FXR水平,从而下调其下游摄取型转运体(NTCP、OATP2)水平以及上调外排型转运体(BSEP、MRP2)水平.

目的 明确金丝桃苷对吡咯里西啶生物碱(PAs)诱导小鼠急性肝损伤的作用及机制.方法 40只C57BL/6雄性小鼠随机分成5组,即空白对照组、模型组以及金丝桃苷低、中、高剂量组,每组8只.除空白对照组外,其余小鼠采用PAs建立急性肝损伤模型,造模6 h、30 h后金丝桃苷低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给予20、40、80 mg/kg金丝桃苷各1次,造模48 h后,收集血清、肝脏、回肠、粪便.检测小鼠血清生化指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆汁酸(TBA)水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠肝脏组织病理学形态变化;测定小鼠血清、肝脏、回肠、粪便中胆汁酸含量;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法及Western blot法检测小鼠肝脏组织中法尼酯X受体(Fxr)、小异源二聚体伴侣(Shp)、胆盐输出泵(Bsep)、胆固醇-7α-羟化酶(Cyp7a1)、甾醇-12α-羟化酶(Cyp8b1)mRNA与蛋白表达水平.结果 与空白对照组比较,模型组血清生化指标ALT、AST、TBA水平显著升高(P<0.05),肝细胞大面积坏死,同时伴有肝窦淤血;与模型组比较,金丝桃苷各剂量组血清生化指标ALT、AST、TBA水平显著降低(P<0.05),金丝桃苷中、高剂量组未见明显肝细胞坏死及肝窦淤血.与空白对照组比较,模型组胆汁酸代谢异常,小鼠肝脏Fxr、Shp、Bsep、Cyp7a1、Cyp8b1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,金丝桃苷中剂量组胆汁酸稳态失衡有所改善,小鼠肝脏Fxr、Shp、Bsep、Cyp7a1、Cyp8b1 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05).结论 金丝桃苷可改善PAs诱导的急性肝损伤,其机制与调控胆汁酸相关基因、维护胆汁酸稳态平衡有关.

目的 探讨茵栀黄颗粒治疗小鼠胆汁淤积症的作用及其机制.方法 将8 周龄C57BL/6 小鼠给予含 1%胆酸的饲料2 周,构建小鼠胆汁淤积症模型,将小鼠分为对照组、模型组、熊去氧胆酸(0.1 g/kg)组以及茵栀黄颗粒(5、10、20 g/kg)组,各组分别ig相应药物,对照组和模型组大鼠ig同体积生理盐水,连续给药 4 周.分别给予收集小鼠血清,全自动生化仪测定肝功能相关指标,超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)测定胆汁酸成分;收集小鼠肝组织,苏木精-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理变化;RT-qPCR检测肝组织炎症因子和胆汁酸代谢关键基因的mRNA表达水平;Western blotting检测肝组织胆汁酸代谢关键蛋白的表达情况;收集小鼠盲肠内容物,Illumina Miseq 测序平台对 V3～V4 可变区进行扩增和测序,对小鼠肠道菌群结构进行分析.结果 与模型组相比,茵栀黄颗粒各组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平均显著降低(P＜0.05、0.01、0.001);且能够显著改善小鼠肝组织损伤.与模型组相比,茵栀黄颗粒各剂量组小鼠肝脏白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA 表达水平均显著降低,白细胞介素-1β(IL-1β)、胆固醇 7-羟化酶(CYP7A1)、胆盐输出泵(Bsep)、牛磺胆酸钠共转运蛋白(Ntcp)、胆汁酸转运蛋白多药耐药相关蛋白 2(Mrp2)、UDP葡糖醛酸基转移酶 1 家族多肽A1(Ugt1a1)mRNA表达水平均显著升高(P＜0.05、0.01、0.001),并影响胆汁酸代谢关键蛋白的mRNA和蛋白表达.16S rDNA测序显示,茵栀黄颗粒组小鼠肠道菌群中乳杆菌属相对丰度显著升高,罗斯氏菌属和Allobaculum属相对丰度显著降低.胆汁酸代谢组学发现,茵栀黄颗粒能够降低多种次级胆汁酸的含量.结论 茵栀黄颗粒改善胆汁淤积的作用机制可能与调控肠道菌群组成影响胆汁酸代谢有关.

目的:观察吡格列酮对小鼠胆盐肠肝循环转运相关基因的表达影响.方法:将16只小鼠随机分为两组:对照组(normal control,NC)、药物组(medicine,M),分别给予普通饮食、普通饮食加吡格列酮(pioglitazone)灌胃,喂养10周后处死小鼠取血、胆汁、小鼠肝脏、小肠组织,生化分析仪分析小鼠血样代谢指标,qRT-PCR技术检测各组小鼠组织内胆盐肠肝循环相关基因的表达.结果:M组小鼠胆汁中胆盐含量NC组显著升高,肝脏法尼醇X受体(famesoid X receptor,FXR)及胆盐合成相关基因胆固醇7羟化酶(eytochrome P450 enzyme7 A1,CYP7A1)、胆固醇27羟化酶(CYP7A1eytochrome P450 enzyme27 A1,CYP27A1)以及胆盐转运基因胆盐输出泵基因(bile salt export pump,BSEP)、牛黄胆酸钠转运基因(sodium/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的表达较NC组也明显升高(P＜0.01).肝脏组织免疫组化证实了M组BSEP在蛋白层面表达升高.M组小肠组织内胆盐转运基因顶膜钠离子依赖性胆汁酸转运体(apical sodium dependent bile acid transporter,ASBT)的表达较NC组明显升高(P＜0.01).结论:吡格列酮能够诱导胆盐合成相关基因的表达,并上调胆盐在肝脏以及小肠内的转运相关基因的表达,在转录水平参与胆盐肠肝循环的调控.

目的:基于黄疸模型比较栀子根与栀子果实的保肝作用,为扩大栀子的药用部位提供药理学依据,为其资源的综合利用提供理论支撑.方法:将KM小鼠随机分为9组,每组10只,分别为正常组,模型组,阳性药联苯双酯组(150 mg·kg-1),栀子果实和根部位不同剂量给药组(各设高、中、低3个剂量),提前灌胃给药5d后采用α-萘异硫氰酸酯(ANIT)复制小鼠黄疸型肝炎模型,继续给药,造模48 h后处理动物测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),γ-谷氨酰转移酶(γ-GT),总胆红素(TBIL),总胆汁酸(TBA),肝脏中超氧化物歧化酶(SOD),还原型谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)水平,苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠肝脏组织病理学变化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定肝组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),转运体胆盐输出泵(BSEP),钠离子-牛磺胆酸协同转运多肽(NTCP)和胆固醇12α羟化酶(Cyp8b1) mRNA的表达.结果:与正常组比较,模型组血清中ALT,AST,γ-GT,TBIL,TBA水平显著升高,组织中SOD,GSH-Px,GSH的活性显著降低,NTCP,Cyp8b1 mRNA的表达显著降低,TNF-α,IL-6,BSEP mRNA的表达显著升高(P＜0.01);与模型组比较,栀子果实与根提取物中、高剂量组均能明显降低血清中ALT,AST,γ-GT,TBIL,TBA,明显增强肝组织中SOD,GSH-Px,GSH的活性,对肝脏病理损伤有减轻作用,且能明显增加NTCP,Cyp8b1 mRNA的表达,明显降低TNF-α,IL-6,BSEP mRNA的表达(P ＜0.05,P＜0.01);而低剂量组仅对单项指标或几项指标有一定的改善作用.结论:栀子果实和根部位对ANIT诱导的黄疸模型小鼠有一定的保护作用,2个部位各剂量对不同指标有不同影响,栀子果实保肝机制可能主要与抗氧化作用和抑制炎症反应有关,而栀子根保肝作用可能主要与胆汁酸代谢有关.