目的:开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array，TLDA)，可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定，适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法:设计甲型流感病毒通用、H1-16亚型、N1-9亚型的引物探针，并将其预先定制在TLDA反应芯片上；优化TLDA退火温度；用多种亚型的甲型流感病毒核酸进行10倍梯度稀释，结合微滴式数字PCR定量方法评价TLDA检测灵敏度；用乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞等其他多种常见的呼吸道病毒验证该TLDA检测特异性，同时选用多种已经明确分型的甲型流感病毒评价该TLDA的特异性和有效性；采集16例流感样病例标本及24例禽流感外环境标本用该芯片开展检测。结果:该TLDA的最佳退火温度为60 ℃；针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9和H9N2，其检测灵敏度为1.52~8.00拷贝/μl；能特异性检测甲型流感病毒，与其他常见呼吸道病毒无交叉反应，并能精准鉴定多种甲型流感病毒的亚型；应用该方法检测16例流感样病例标本和24例禽流感外环境监测标本，均可分型。结论:基于TLDA技术建立的甲型流感病毒高通量快速分型检测方法具有较好的灵敏度和特异性，适用于流感样病例和禽流感标本的病原快速检测，特别是对目前用常规商业化试剂尚无法鉴定的新型甲型流感病毒能够进行快速的亚型筛查与鉴定。

目的:建立同时检测疱疹病毒(human herpesvirus, HHV)-6A、B和核糖核酸酶P/MRP 30 kDa亚基(RPP30)的三重芯片式数字PCR(chip digital PCR，cdPCR)方法确定HHV-6A与HHV-6B感染的病毒载量，及高病毒载量的HHV-6是否由病毒整合到染色体导致。方法:根据已建立的HHV-6A、HHV-6B实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)方法，建立HHV-6三重cdPCR方法。分别使用HHV-6A、HHV-6B病毒培养物进行敏感性检测，并与其他疱疹病毒进行特异性检测。随后，使用127份全血样本进行三重cdPCR方法验证。结果:HHV-6 cdPCR与RT-qPCR方法检测结果的相关性良好(R 2>0.97)，且与其他疱疹病毒无交叉反应。对经RT-qPCR与cdPCR检测均为阳性的14份样本，经三重cdPCR方法检测，得到HHV-6A和HHV-6B的最低检测病毒载量分别为50拷贝/ml和105拷贝/ml。并且14份样本中HHV-6病毒载量与(RPP30拷贝数/2)的比值均小于1。 结论:建立的三重cdPCR具有较好的敏感性和特异性，且HHV-6三重cdPCR方法可以定量检测HHV-6A、HHV-6B的病毒载量以及RPP30的拷贝数。通过检测样本中HHV-6病毒载量与(RPP30拷贝数/2)的比值，可以确定高病毒载量的HHV-6是否存在染色体整合。

目的 为了对肉制品中牛肉源性成分进行准确定量,本文采用数字PCR(dPCR)技术对牛肉的线粒体Cytb基因进行定量检测,根据基因拷贝数建立了肉制品中牛肉源性成分PCR的定量检测方法.方法 参照标准设计的牛源性特异性引物、探针,猪源性特异性引物、探针,鸭源性特异性引物、探针以及动物源性成分通用引物、探针,建立了双重数字PCR体系.结果 在一定范围内生鲜牛肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数(C)与生鲜牛肉质量之间的换算公式:M 牛=0.020 9C+0.676.应用建立的dPCR方法对构建的肉样模型进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致,且受外源物种的干扰小.运用该方法对抽取的10份市售牛肉样品检测,同时通过特异/通用引物扩增的拷贝数之比(％)辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假,检测出部分样品不符合标签规定.结论 该方法可实现对牛源性成分的量化检测,能够作为区分故意添加和无意污染的依据,为执法监管部门提供有力的技术保障.

目的 对芯片式数字PCR检测禽流感病毒的方法进行评估,并与荧光定量PCR方法进行比较.方法 分别用芯片式数字PCR(dPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)两种方法检测不同浓度梯度的质粒标准品,对两种方法检测结果的线性范围,一致性,批内精密度,最低检出限等方面进行比较评估.并对31份农贸市场禽流感环境标本分别用数字PCR和实时荧光定量PCR检测,利用配对卡方检验来评估两种方法阳性率的差异,并用Bland-Altman法分析与荧光定量PCR方法的一致性.结果 质粒标准品在 3.05×102 copies/mL～1.00×107 copies/mL的浓度范围内,与dPCR检测值呈良好的线性关系,R2=0.9969,dPCR和qPCR在线性范围内斜率之间的差异无统计学意义(F=0.996,P=0.321);dPCR在不同稀释度的批内精密度变异系数(CV)范围为2.36%～22.78%;dPCR的估计检测下限(LOD)为410(95%CI:344～570)copies/mL,qPCR的估计LOD为845(95%CI:749～1 004)copies/mL;用dPCR和qPCR检测31份农贸市场环境标本,dPCR的检出率96.8%,qPCR的检出率80.6%(Kappa=0.244,P=0.063).结论 本研究验证了芯片式数字PCR系统的性能及其与荧光定量PCR系统的方法学比较.芯片式数字PCR在其动态范围内表现出良好的线性,R2=0.996 9,能够准确且高精度(CV)范围为2.36%～22.78%的定量不同浓度(3.05×102～1.00×107 copies/mL)的复杂样本.

目的 建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性.方法 提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性.结果 未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10％,Luc和RPP30的线性拟合R2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50％～100％之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致.该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致.结论 建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价.

目的 综合评估3种游离核酸(cfDNA)提取试剂盒,以筛选出经济可靠的商品试剂盒.方法 我们使用了3种不同的试剂盒提取10名健康人血浆中的cfDNA,并使用Agilent 2100生物芯片分析仪对cfDNA片段大小和丰度进行评估.同时,我们还使用微滴式数字PCR(ddPCR)对cfDNA中的核糖核酸酶P蛋白亚基p30(RPP30)、NADH脱氢酶亚基1(ND1)、NADH脱氢酶亚基4(ND4)基因拷贝数进行定量,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测cfDNA中藤黄节杆菌序列(ALU)ALU115和ALU247的浓度.此外,我们还在混合血浆中掺入50～766 bp的DNA Ladder,然后使用上述3种提取试剂盒对其进行提取,并使用Agilent 2100生物芯片分析仪分析各DNA片段的浓度,以计算不同试剂盒对不同大小的DNA片段的回收率和提取偏好性.结果 3种试剂盒从健康人血浆中纯化的100～300 bp cfDNA浓度分别为(5.10±1.99)、(4.64±3.09)和(1.82±1.29)ng/mL(P = 0.006).Kit A所提取的RPP30拷贝数显著高于Kit C(P = 0.018),而Kit A和Kit B所提取的ND1和ND4拷贝数也均显著高于Kit C(P = 0.001;P = 0.001;P = 0.001;P = 0.001).此外,Kit A所提取的cfDNA中,ALU 115和ALU 247的浓度也显著高于Kit C(P = 0.009;P = 0.003).3种试剂盒对混合血浆中掺入的外源性DNA Ladder的回收率差异有统计学意义(P<0.001),同时Kit B和Kit C对不同大小的DNA片段也存在提取偏好性.结论 Kit A性能最佳,Kit B是一种低成本替代方案,其工作流程更简单省时.

目的 建立芯片式数字PCR技术用于乙型肝炎病毒的绝对定量检测,并对此方法的灵敏度、检出限、检测范围开展评估.方法 本研究设计了芯片式数字PCR用于乙型肝炎病毒绝对定量检测的引物探针,并对扩增条件、反应的体系进行了优化,采用阴性对照法和稀释法对检出限、检测范围和检测方法的重复性进行评估.同时与实时荧光定量PCR的结果作了平行比较.结果 芯片式数字PCR检出限为3.94×104 copies/ml,检测范围是3.94×104 copies/ml～2.82 ×107copies/ml,重复性的相对标准偏差(RSD)为2.89％～13.37％.相比较实时荧光定量PCR,对样本的浓度要求苛刻,高稀释倍数与阴性对照均出现阳性.结论 本研究建立了芯片式数字PCR技术用于乙型肝炎病毒的绝对定量方法,不必依赖对照品或标准品,可高度耐受PCR反应抑制剂,为乙型肝炎病毒载量的测定提供了一种新的检测手段.

目的 建立芯片式数字PCR绝对定量技术,用于登革病例血清中登革病毒载量绝对定量并分析载量变化情况.方法 选取发病1～7d登革实验室确诊病例血清样本,提取病毒RNA并逆转录为cDNA,取3μL或4.5μL cDNA,配制15μL反应体系,采用QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader仪器制作芯片,将芯片置于Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700运行PCR,最后在QuantStudio TM3D Digital PCR System中读取结果并应用QuantStudio TM 3D AnalysisSuite TM Software进行分析,根据实验稀释倍数计算血清中登革病毒载量.结果 芯片制作良好,有效孔数高,检测结果重复性较好,示病例发病第1～7d血清中的登革病毒载量分别是107.646,107.544,107.298,106.990,105.823,104.732,104.221 copies/mL.结论 应用芯片式数字PCR检测血清中登革病毒载量的方法可行,可应用于登革病毒载量的绝对定量.登革病毒载量随着病程的发展而降低.

1999 年 ,VOGELSTEIN 等[1]正式提出了数字聚合酶链反应(dPCR)的概念 . 目前 ,dPCR 主要分为 3类 :微反应室/孔板数字 PCR 、微流控芯片数字 PCR和微滴式数字聚合酶链反应 (ddPCR ) [1-3] . 其中 , ddPCR 是利用微滴发生器将反应体系一次性生成单分子水平的油包水微滴 ,再独立地进行循环扩增反应 ,扩增结束后分别对每个反应单元的荧光信号进行采集 ,有荧光信号的标记为"1" ,无荧光信号的标记为"0" ,使用泊松概率分布函数进行计算 ,最终得出反应体系最初的 DNA 拷贝量 . ddPCR 与实时荧光定量PCR(qPCR)采用相同的引物及探针 ,通过有限稀释法和泊松分布原理直接定量分析 ,计算出 DNA 水平 .这种技术无须依赖标准曲线和循环阈值(Ct 值) ,并且检测下限可低至单拷贝而达到真正意义上的绝对定量 .ddPCR 已被运用于低丰度和复杂来源的病原微生物核酸检测 、肿瘤标志因子检测 、拷贝数变异分析 、microR-NA 表达分析和无创产前检测等众多领域[4-7] .

针对基于RNAi技术的转基因玉米品系,研究并建立了一套逆转录芯片式数字PCR(dPCR)定量检测该品系玉米双链RNA的方法.研究内容主要包括RNA提取方法、引物探针设计、逆转录方法、dPCR反应条件及体系等方面的探索和优化.该方法的绝对定量限为2.5 copies/μL,RSD为12.4％;检测低浓度实际样品达21.7 copies/μL时,相对偏差为2.7％,RSD为14.6％,满足国际上转基因定量结果RSD≤25％的要求.将该方法用于基于RNAi技术转基因作物的定量检测,将为我国相关转基因作物的安全评价提供了精确可靠的技术手段.