目的 探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者癌组织卷曲蛋白3(frizzled 3,FZD3)、蓬乱蛋白2(dishevelled 2,DVL2)表达水平及其临床预后意义.方法 选取2018-09/2020-09月作者医院收治的105例NSCLC患者为研究对象,手术留取癌组织和癌旁组织并制作成标本.采用免疫组织化学法检测FZD3、DVL2在癌组织和癌旁组织标本中的表达情况;分析FZD3、DVL2表达水平与NSCLC患者临床特征的关系,并分析影响NSCLC患者预后的相关因素.结果 癌组织中FZD3阳性表达率、DVL2阳性表达率均高于癌旁组织(P均＜0.05).临床分期为Ⅲ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移的NSCLC患者FZD3阳性表达率和DVL2阳性表达率高于临床分期为Ⅱ期、分化程度为中/高分化、无淋巴结转移的NSCLC患者(P均＜0.05).FZD3阳性表达、DVL2阳性表达的NSCLC患者的3年总生存率低于FZD3阴性表达、DVL2阴性表达的NSCLC患者(P均＜0.05).多因素Cox回归分析显示,分化程度低(HR=2.524,95％CI:1.669～3.817)、有淋巴结转移(HR=2.959,95％CI:1.897～4.618)、FZD3 阳性表达(HR=3.111,95％CI:1.982～4.883)、DVL2 阳性表达(HR=3.476,95％CI:2.155～5.608)是 NSCLC 患者预后的独立危险因素(P＜0.05).结论 FZD3、DVL在NSCLC组织中表达上调,且与临床分期、分化程度、淋巴结转移有关,有望作为NSCLC预后评估的生物学标志物.

目的 探讨安五脂素改善大鼠肝纤维化的效果及作用机制.方法 将50只SD大鼠随机分为正常组,模型组,秋水仙碱片组(0.1 mg/kg),安五脂素高、低剂量组(2.8、0.7 mg/kg),每组10只.除正常组外,其余各组大鼠均腹腔注射50%CCl4橄榄油混合溶液复制肝纤维化大鼠模型.造模结束后,各组大鼠从第9周开始灌胃相应药物或蒸馏水,每日1次,连续给药4周.实验期间观察大鼠一般情况;计算大鼠肝指数;采用比色法检测大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量;采用HE染色和Masson染色观察大鼠肝组织病理形态学和肝纤维化情况;采用Western blot法检测肝组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路及凋亡相关蛋白表达水平.结果 与正常组比较,模型组大鼠饮食量下降,被毛稀疏、蓬乱,反应迟钝,体重增长速率减慢或体重降低;肝指数显著上升(P＜0.01);大鼠血清中ALT、AST、MDA含量均显著升高,SOD含量显著降低(P＜0.01);HE染色及Masson染色均观察到大鼠肝组织中有大量纤维增生,胶原容积分数显著升高(P＜0.01);大鼠肝组织中PI3K、Akt、磷酸化Akt、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达水平均显著下降,Bcl-2相关X蛋白表达水平显著升高(P＜0.01).与模型组比较,安五脂素高、低剂量组及秋水仙碱片组上述指标均显著逆转(P＜0.01或P＜0.05).结论 安五脂素可能是通过激活PI3K/Akt信号通路降低肝纤维化氧化应激反应、抑制肝细胞凋亡,发挥抗肝纤维化的作用.

目的 探讨苓桂术甘汤(LGZG)通过调控自噬增强多柔比星(DOX)的抗非酒精性脂肪肝病相关肝细胞癌(NAFLD-HCC)的作用及机制.方法 将C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为空白组、NAFLD-HCC组、LGZG组、DOX组、DOX+LGZG组,每组10只.采用腹腔注射二乙基亚硝胺溶液(50 mg/kg)和喂养高脂饲料相结合的方法建立NAFLD-HCC小鼠模型;空白组小鼠注射等量生理盐水,给予普通饲料喂养.建模后,各给药组分别灌胃LGZG水提液(20 g/kg)和/或腹腔注射DOX溶液(8 mg/kg),空白组、NAFLD-HCC组灌胃等量生理盐水,每日1次,连续4周.在模型建立及药物干预期间,监测小鼠的一般情况.药物干预结束后,检测小鼠体重、肝重及肝脏系数;观察小鼠肝脏组织病理形态和纤维化程度;检测小鼠血脂水平[甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平],血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)含量,肝脏组织中增殖标志物Ki-67、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平,以及微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3)、苄氯素1(Beclin1)、选择性自噬接头蛋白P62的蛋白表达水平.结果 与空白组比较,NAFLD-HCC组小鼠随着给药时间延长活动逐渐减少,精神萎靡,毛发蓬乱无光泽,体重显著降低(P＜0.05),肝重有上升趋势,肝脏系数显著增加(P＜0.05);小鼠肝脏组织炎症细胞大量浸润,部分细胞出现气球样变及小细胞性增生的病变,肝脏纤维化程度加重;血清中TC、TG、LDL-C水平及AFP、CEA含量均显著升高,HDL-C水平显著降低(P＜0.05);肝脏组织中Ki-67、Bcl-2蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05),Bax蛋白表达水平有降低趋势;肝脏组织中Beclin1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有所降低,P62蛋白表达水平有所升高.与NAFLD-HCC组比较,DOX组、LGZG组及DOX+LGZG组小鼠上述指标均有不同程度改善,且DOX联合LGZG的干预效果优于DOX.结论 LGZG联合DOX能够协同促进肿瘤细胞的凋亡,增强NAFLD-HCC化疗敏感性,有效减缓NAFLD-HCC的发生发展,其机制可能与调节肿瘤细胞自噬的发生有关.

目的 用分子对接技术探讨苍耳亭在上皮间质转化(EMT)过程中的作用靶点,并通过Western Blotting实验检测其对肝癌HepG2细胞相应靶点蛋白表达的影响.方法 选取在EMT过程中的关键因子蓬乱蛋白(Dhs)、波形蛋白(Vimentin)、Snail、血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)为作用靶点,采用分子对接虚拟技术评价苍耳亭与其空间结合能力,并与相应内源性物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、醋酸离子、黄素腺嘌呤二核苷酸、N-乙酰葡糖胺对比;培养HepG2细胞,给予1、5、20 μmol/L浓度的苍耳亭,利用Western Blotting实验检测其对Dhs、Vimentin、Snail、VEGFR3蛋白表达的影响.结果 分子对接结果显示,苍耳亭与EMT过程中作用靶点均具有一定亲和力,其中与Dhs、Snail、VEGFR3的亲和力高于内源性物质,与Vimentin的亲和能力不及内源性物质;Western Blotting实验结果显示,苍耳亭显著下调Vimentin、Snail、VEGFR3蛋白的表达,显著上调E-cadherin蛋白表达(P＜0.05、0.01、0.001).结论 苍耳亭对肝癌侵袭转移关键因子E-cadherin、Vimentin、Snail、VEGFR3有明显影响,可能是其潜在靶点;分子虚拟对接和Western blotting实验结果具有一定的相似性,能预先提示潜在靶因子.

目的 探讨HCT116细胞和HCT116球细胞的成瘤能力及其蓬乱蛋白3(dishevelled 3,DVL3)的表达.方法 采用无血清培养法培养人结直肠癌HCT116细胞,以获得HCT116球细胞,并通过克隆形成实验(3个复孔)和裸鼠皮下成瘤实验(20只裸鼠),分别在体内、外观察HCT116细胞及HCT116球细胞的集落形成能力和成瘤能力,再采用Western blotting法检测DVL3在2种细胞中的表达情况.结果 ①集落形成情况:HCT116细胞组的克隆形成率均值为3.78％,HCT116球细胞组为28.67％,HCT116球细胞组的克隆形成率较高(t=21.16,P＜0.05).②裸鼠皮下成瘤能力:HCT116细胞组形成肿瘤1 1只,肿瘤形成率为55.0％;HCT116球细胞组形成肿瘤18只,肿瘤形成率为90.0％,高于HCT116细胞组(P=0.039);HCT116细胞组裸鼠的肿瘤体积为(92±31) mm3,HCT116球细胞组为(298±85)mm3,HCT116球细胞组裸鼠的肿瘤体积较大(t=9.27,P＜0.05).③DVL3的表达:HCT116细胞中DVL3的表达水平为0.12±0.05,HCT116球细胞为0.35±0.10,HCT116球细胞中DVL3的表达水平较高(t=4.31,P＜0.05).结论 HCT116球细胞较HCT116细胞具有更强的促集落形成能力和致瘤能力,且DVL3的高表达可能与HCT116球细胞较强的致瘤能力有关.

目的 研究蓬乱蛋白2(Dvl2)在高脂血症大鼠种植体周围早期的表达.方法 24只雄性Wistar大鼠,随机均分为实验组和对照组,分别给予高脂和普通饲料.8周后,检测大鼠血脂水平并于股骨干骺端植入种植体,术后l、3、5 d处死,获得种植体周围骨组织.采用亚甲基蓝-酸性品红染色观察种植体-骨界面,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runt相关转录因子2(Runx2)、组织蛋白酶K(CatK)和Dvl2的表达,免疫印迹和免疫共沉淀法检测Dvl2、磷酸化Dvl2和泛素化Dvl2的表达.结果 与对照组相比,实验组的成骨细胞、Runx2、Dvl2和磷酸化Dvl2减少(P.＜0.05),而破骨细胞、CatK和泛素化Dvl2增多(P＜0.05).结论 高脂血症可能通过上调Dvl2及磷酸化、下调泛素化而抑制种植体周围早期骨改建.

目的 研究不同切应力对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路的影响及其与动脉粥样硬化的关系.方法 采用切应力加载装置对HUVEC分别加载(0、1、15)达因/cm2切应力6、12、18、24h后,采用实时定量PCR检测该信号通路β-catenin和蓬乱蛋白2(Dvl2)的mRNA水平,免疫荧光技术检测β-catenin、Dvl2的表达和细胞定位.结果 低切应力不仅能够促进Dvl2在胞质中的募集,而且能够促进其β-catenin发生核转移.相反,层流切应力能够抑制Dvl2的表达、细胞定位以及β-catenin的核转移.结论 Wnt信号通路参与血管内皮细胞对低切应力的响应.

目的:探讨蓬乱蛋白2(Dvl2)对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响.方法:用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理心肌细胞48 h,Western Blot检测Dvl2的表达.用重组腺病毒Ad-GFP和Ad-Dvl2分别感染大鼠原代心肌细胞24h后用Ang Ⅱ处理48 h,利用免疫荧光技术检测心肌细胞面积,免疫印迹实验检测心肌肥大标志物β-MHC和相关信号通路.结果:AngⅡ处理引起Dvl2表达增加;与对照组相比,Ad-Dvl2感染显著增强了AngⅡ诱导的心肌细胞肥大和β-MHC表达增加,而Dvl2过表达引起蛋白激酶B(AKT)磷酸化的增加.结论:Dvl2能促进AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其作用机制可能与激活AKT信号通路相关.

目的:研究体外果蝇裸露角蛋白2(naked cuticle homolog 2,Nkd2)对大鼠牙囊细胞(rat dental follicle cells,rDFCs)成骨向分化的调控机制.方法:体外培养rDFCs,鉴定其组织来源并进行成骨向分化诱导,茜素红染色验证其成骨向分化能力,激光共聚焦检测检测Nkd2在中rDFCs的表达;采用小RNA干扰技术,干扰rDFCs中的Nkd2表达后进行成骨向分化诱导,western blot检测小RNA干扰对rDFCs表达成骨向分化因子Runx2、Col-1和OCN的影响;免疫荧光染色检测3-catenin在rDFCs中的分布变化,western blot检测小RNA干扰对rDFCs表达蓬乱蛋白1(Dishevelled-1,Dvl-1)的表达变化和Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a与阻断剂FH535处理rDFCs后Nkd2的表达改变.结果:获得体外培养的rDFCs,并成功诱导其成骨向分化,茜素红染色显示矿化结节形成.Nkd2在rDFCs中的表达主要分布于胞浆和胞核周围.Nkd2小RNA干扰后的rDFCs中Runx2、Col-1蛋白表达明显下调,Dvl-1的表达下调.同时,Wnt3a处理组rDFCs中Nkd2蛋白表达量升高,而FH535处理组的表达量下降.结论:Nkd2通过Dvl-1调控Wnt/β-catenin信号通路促进rDFCs的成骨向分化;Nkd2是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因,对Wnt/β-catenin信号通路起正反馈调节作用.

目的 研究高脂与正常环境下大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)成骨分化过程中4种微RNA对蓬乱蛋白2的靶向调节作用及其对BMSC成骨分化的影响.方法 分别用普通(对照组)和高脂(高脂组)成骨诱导液培养BMSC,第3、5、7、14、21天实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)分析4种微RNA (micro RNA,miR) (miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p及miR-351-5p)、蓬乱蛋白2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关基因2(Runt-related transcription gene 2,Runx2)mRNA相对表达量,蛋白质印迹法分析蛋白表达;BMSC分别转染微RNA模拟物、抑制物和相应阴性对照(分别为模拟物组、抑制物组和相应阴性对照组),高脂成骨诱导后检测第1、3、5、7天ALP活性;第7天行ALP染色,蛋白质印迹法分析蓬乱蛋白2、ALP、Runx2的蛋白表达,qPCR分析蓬乱蛋白2 mRNA表达.构建蓬乱蛋白2野生型和突变型双荧光酶报告质粒,每种质粒分别与4种微RNA模拟物或相应阴性对照共转染293T细胞,检测荧光素酶活性.结果 成骨诱导各时间点高脂组BMSC的miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p及miR-351-5p相对表达量均较对照组高,第21天分别高20％、60％、340％、4420％ (P＜0.05).转染miR-21-5p、miR-29c-3p模拟物后BMSC蓬乱蛋白2、ALP、Runx2蛋白表达均降低;其中miR-29c-3p模拟物组蓬乱蛋白2比相应阴性对照组下降35％(P＜0.05),miR-29c-3p抑制物组蓬乱蛋白2比相应阴性对照组上调269％ (P＜0.05).共转染野生型质粒与miR-29c-3p模拟物后,293T细胞荧光素酶活性受到抑制,较相应阴性对照组下降60％(P＜0.05).结论 高脂环境下BMSC成骨分化受到抑制,miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p及miR-351-5p可能参与BMSC成骨分化调控;miR-29c-3p通过靶向调控蓬乱蛋白2表达而发挥抑制BMSC成骨分化的作用.