目的:探究中华眼镜蛇毒致广西巴马小型猪坏死组织渗出液中的蛇毒成分及其蛋白表达的动态变化.方法:给予广西巴马小型猪注射中华眼镜蛇毒,构建蛇伤中毒的局部组织坏死模型,在注射毒素后的6 h、12 h、24 h、36 h和48h取小猪坏死组织的渗出液,采用无标记的蛋白质组学技术鉴定分析渗出液中蛇毒蛋白质组成及动态变化,通过对所鉴定出的蛋白进行KEGG及GO通路富集分析,以深入了解蛇毒蛋白相关的生物学功能.结果:通过蛇伤中毒后广西巴马小型猪的生物学行为、局部肌肉组织的病理结果、注射部位的伤口变化来评判动物模型,广西巴马小型猪中毒后出现呼吸急促、肌肉组织坏死、局部伤口溃烂等症状,均符合临床特征的实际情况,表明成功构建了中华眼镜蛇毒导致局部组织坏死的广西巴马小型猪模型.在广西巴马小型猪的局部组织坏死渗出液中鉴定到40种蛇毒蛋白质,涵盖三指毒素、磷脂酶A2、富含半胱氨酸分泌蛋白、蛇毒金属蛋白酶、核苷酸焦磷酸/磷酸二酯酶等蛇毒蛋白家族,并呈现出动态性数量变化.结论:在中华眼镜蛇毒致广西巴马小型猪过程中,不同时间段的组织渗出液中均鉴定出多种三指毒素、磷脂酶A2等蛇毒蛋白,其可能在局部组织坏死中发挥着重要作用.

目的:研究α-眼镜蛇神经毒素(α-cobratoxin，α-CbTX)对小鼠的镇痛作用及脊髓背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)内蛋白激酶A( protein kinase A，PKA)活性的影响。方法:健康雄性ICR小鼠( n＝102)采用随机数字表法分为α-CbTX低、中、高剂量组(剂量分别为1 mg/kg、3 mg/kg、9 mg/kg，灌胃，每组 n＝21)、溶剂对照组(等体积0.9%氯化钠溶液，灌胃， n＝21)和吗啡阳性对照组(3 mg /kg，腹腔注射， n＝6)或阿司匹林阳性对照组(300 mg/kg，灌胃， n＝12)。采用热板实验、醋酸扭体实验及福尔马林舔足实验评价α-CbTX的镇痛效应。采用福尔马林足底注射诱发疼痛30 min后，取L4~L6背根神经节，采用Western blot检测各组小鼠DRG内PKA C-α表达变化。采用SPSS 16.0进行统计分析，热板实验数据采用重复测量方差分析，其他实验数据用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD- t检验。 结果:在热板实验中，小鼠舔爪潜伏期的组别和时间的交互作用显著( F＝8.902， P<0.05)；小鼠给药后0.5 h，α-CbTX中剂量组[(11.83±1.47)s]、高剂量组[(14.33±12.1)s]舔爪潜伏期均长于溶剂对照组[(8.17±0.75)s] ( t＝ 4.461，7.053，均 P<0.05)，α-CbTX中剂量组药效持续到给药后1.5 h(均 P<0.05)，α-CbTX高剂量组药效持续到给药后2 h(均 P<0.05)。在醋酸扭体实验中，α-CbTX低、中、高各剂量组小鼠扭体次数[(34.50±3.62)次、(26.17±2.40)次、(13.83±3.76)次]均明显低于溶剂对照组[(42.50±4.59)次]( t＝3.938，8.040，14.112，均 P<0.05)。在福尔马林实验Ⅱ相时间段，α-CbTX低、中、高各剂量组小鼠舔爪总时间[(71.17±6.46)s、(54.67±6.41)s、(40.50±3.89)s]均明显短于溶剂对照组[(98.67±11.50)s] ( t＝6.950，11.120，14.700，均 P<0.05)。在Western blot检测实验中，与溶剂对照组[(0.22±0.01)]比较，α-CbTX低、中、高各剂量组小鼠DRG中PKA C-α[(0.31±0.02)、(0.41±0.03)、(0.44±0.02)]表达均上调( t＝3.140, 6.471，7.492，均 P<0.05)。 结论:α-CbTX具有明显的镇痛作用，其镇痛机制可能与激活蛋白激酶A的活性有关。

全球已发现的蛇类超过4 000种，其中一半以上是游蛇，毒蛇约占20%（800余种），其中眼镜蛇科400多种，蝰蛇科超380种 [1]，医学上有重要意义的毒蛇近250种 [2]。蛇咬伤是重要的公共卫生问题，主要发生于赤道两侧温暖地区，东南亚、撒哈拉以南的非洲地区和南美洲等地最为多见，95%的蛇咬伤发生在发展中国家。全世界每年发生蛇咬伤450~540万例次，约20%是未排毒的"干咬" [3]（即毒蛇咬合时没有释放毒素，不产生中毒症状和体征，或仅有轻微伤口表现）；年蛇咬伤严重中毒者约180~270万，近40万毒蛇咬伤者发生不同程度的残疾 [4,5]。造成8.1~13.8万人死亡，年人群病死率高达0.8/10万 [6]。

目的:探讨DMSO提取的香烟尘雾颗粒(DSP)暴露对小鼠气道反应性的影响和分子机制。方法:实验性研究。将32只8周龄SPF级Balb/c小鼠随机分为对照组、低剂量DSP (0.75 ml/L)组、中剂量DSP (1.5 ml/L)组、高剂量DSP(3 ml/L)组。每组小鼠自鼻腔滴入含0.3% DMSO无菌生理盐水或含不同浓度的DSP溶液(每只20 μl)，连续处理7 d。Myograph测定ET A受体激动剂ET-1和ET B受体激动剂蝰蛇毒素对气管环收缩的作用。Western blot检测气管中ET A、ET B、ERK 1/2、p-ERK 1/2、p65、p-p65的表达。 结果:与对照组相比，DSP滴鼻浓度依赖性增强蝰蛇毒素和ET-1对气管环的收缩效应，气管环浓度-收缩曲线左移。DSP滴鼻浓度依赖性增加小鼠气管ET A、ET B蛋白水平。高剂量DSP滴鼻显著升高小鼠气管p-ERK 1/2和p-p65水平。 结论:香烟尘雾颗粒可能通过激活ERK 1/2/NF-κB和上调内皮素受体表达引起气道高反应性改变。

目的:评价右美托咪定对内毒素血症小鼠海马谷氨酸含量及NR1表达的影响及胆碱能抗炎通路在其中的作用。方法:清洁级雄性C57BL/6小鼠80只，8周龄，体重24～28 g，采用随机数字表法分为4组( n＝20)：对照组(C组)、内毒素血症组(LPS组)、右美托咪定组(DEX组)和α-银环蛇毒素组(α-BGT组)。LPS组、DEX组和α-BGT组分别腹腔注射LPS 20 mg/kg制备内毒素血症模型；DEX组和α-BGT组于造模前15 min时腹腔注射右美托咪定40 μg/kg；α-BGT组于注射右美托咪定前15 min腹腔注射α7nAchR特异性拮抗剂α-银环蛇毒素1 μg/kg。造模后6 h时，每组取10只小鼠，眼球取血样后处死，分离海马组织，采用ELISA法测定血清S100β蛋白和NSE浓度，采用高效液相色谱法测定海马谷氨酸含量。造模后6 h时，每组处死10只小鼠，采用免疫荧光法检测海马NR1表达。 结果:与C组比较，LPS组、DEX组和α-BGT组血清S100β蛋白和NSE浓度升高，海马谷氨酸含量和NR1表达水平升高( P<0.01)；与LPS组比较，DEX组和α-BGT组血清S100β蛋白和NSE浓度降低，海马谷氨酸含量和NR1表达水平降低( P<0.01)；与DEX组比较，α-BGT组血清S100β蛋白和NSE浓度升高，海马谷氨酸含量和NR1表达水平升高( P<0.01)。 结论:右美托咪定减轻内毒素血症小鼠脑损伤的机制与激活胆碱能抗炎通路，降低谷氨酸含量，下调NR1表达有关。

目的 建立一种人体血清中心脏毒素的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS-MS)的检测新方法.方法 向100μl血清样品中加入300 μl乙腈沉淀蛋白,-20℃冷冻2 h,高速离心10 min,取上层有机相用纯水按照1:1比例稀释,然后过膜、上机测定.样品分离采用梯度洗脱模式,流动相为0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸乙腈溶液,柱温为70℃,Protein BEH C4色谱柱分离,采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式测定血清中心脏毒素浓度,外标法定量分析.结果 心脏毒素在2.0～200.0 μg/L范围内呈现良好的线性关系,r=0.999 2.该方法的回收率为98.6％～115.0％,RSD为3.6％～9.8％;检出限为0.6μg/L.结论 该方法操作简单,灵敏度和准确度均较高,适用于血清中心脏毒素的快速测定.

目的 探讨电刺激迷走神经对脓毒症小鼠肠道通透性的作用及机制.方法 将50只C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON组)、脓毒症组[脂多糖(LPS)组]、迷走神经切断组(VGX组)、电刺激迷走神经组(STM组)、α-银环蛇毒素(α-BGT)组,每组10只.LPS组、VGX组、STM组、α-BGT组均腹腔注射10 mg/kg LPS制备脓毒症模型,CON组则腹腔注射等体积生理盐水.CON组、LPS组仅暴露双侧颈迷走神经,VGX组、STM组、α-BGT组均切断双侧颈迷走神经,STM组电刺激左颈迷走神经,α-BGT组皮下注射α-BGT后再电刺激左颈迷走神经.处死各组小鼠后取回肠组织,光镜下进行组织病理学观察,评估肠道组织通透性,并检测紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-2)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和核因子-κB(NF-κB)蛋白相对表达量.结果 LPS组小鼠回肠组织肠黏膜上皮细胞损伤严重,微绒毛坏死、脱落,大量炎性细胞浸润,VGX组回肠组织病理学改变程度较LPS组加重,STM组回肠组织病理学改变程度较LPS组、VGX组减轻,α-BGT组肠黏膜上皮细胞损伤最严重.与CON组比较,LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织通透性均增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与LPS组、VGX组比较,STM组小鼠肠上皮组织通透性降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与STM组比较,α-BGT组小鼠肠上皮组织通透性增加,差异有统计学意义(P＜0.05).LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量低于CON组,STM组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量高于LPS组、VGX组,α-BGT组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量低于STM组,差异均有统计意义(P＜0.05).LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量高于CON组,STM组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量低于LPS组、VGX组,α-BGT组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量高于STM组,差异均有统计意义(P＜0.05).结论 电刺激迷走神经有助于保护脓毒症小鼠的肠道屏障功能,其潜在机制或与激活胆碱能抗炎通路,进而抑制炎症反应相关.

毒蛇咬伤具有发病急、病情变化迅速、致残率及死亡率高等特点.毒素螯入对人体的影响分为全身性和局部毒化作用,目前抗蛇毒血清的普及大大降低了毒蛇咬伤的死亡率,但局部组织损伤及遗留的永久性功能障碍仍是亟待解决的问题.研究发现,蛇毒金属蛋白酶、透明质酸酶、磷脂酶等毒素通过干扰细胞外基质(ECM)的降解和重塑参与多种局部病理效应的发生.本文对ECM与毒蛇咬伤局部组织损伤发展过程的相关机制进行综述,以期寻找有效的治疗靶点,为毒蛇咬伤所致局部组织损伤的临床研究和防治工作提供参考和思路.

目的 筛选多种常用的微针基质辅料,制备具有合适机械强度和柔韧性的载中华眼镜蛇神经毒素(neurotoxin,NT)可溶性微针(dissolvable microneedles,DMN)(DMN-NT),并对其进行体内外评价.方法 采用两步真空模板填充法制备不同材料构成的DMN,并对其进行力学特性分析,通过重量法对其吸湿性进行考察,利用正置显微镜对其形态特征进行考察,筛选最佳基质材料后制备DMN-NT,并对微针的载药量、机械性能、在体溶解、在体恢复、体外释放度、离体皮肤渗透与稳定性等进行评价.结果 针尖最佳基质材料为20％聚乙烯吡咯烷酮K90(PVPK90)和20％透明质酸(相对分子质量为10000),背衬层最佳基质材料为7.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC,E5LV型)和15％聚乙烯醇(PVA-0588).正置显微镜和体式显微镜下观察发现DMN-NT针体垂直,排列整齐;每片DMN-NT的载药量为(172.22±1.30)μg或(17.38±0.57)μg;力学性能测试结果显示,DMN-NT针尖受力可达(39.88±3.09)N,大于微针穿刺皮肤所需的破坏力0.05N,表明DMN-NT有较好的机械强度,亚甲基蓝染色实验结果表明微针具有较好的穿刺性;在体溶解实验结果显示,在10min内DMN-NT大部分溶解;在体恢复实验结果为给药30min后针孔痕迹几乎不见,表明DMN-NT的生物相容性好,安全性高;体外释放结果表明DMN-NT在pH值为7.4的PBS中8min的累积释放率达(93.65+4.29)％;离体皮肤渗透结果显示,10h后微针的累积药物渗透百分率达到(97.99+2.80)％,而药物水溶液中药物几乎没有透过皮肤;DMN-NT稳定性初步评价结果良好.结论 制备的DMN可以穿刺皮肤角质层,具有较好的溶解性和生物相容性,可以高效经皮递送大分子药物.

蛇毒已被证明具有抗炎活性,其中包含许多免疫原性弱、活性强的短肽小分子.蛇毒腺是分泌毒液的器官,含有毒素成分及调控其分泌过程的大量生物活性成分.缓激肽2型受体(B2R)参与重要的细胞内信号通路,作为炎症的调节因子成为潜在的抗炎药物开发的靶点.为了获得特异性的B2R结合肽,利用尖吻蝮蛇Deinagkistro-don acutus毒腺T7噬菌体文库对靶点B2R进行3轮生物淘选,测序获得了多个具有潜在结合能力的序列.通过序列长度、溶解性预测、稳定性预测和分子对接等一系列生物信息学分析,最终确定1个含25个氨基酸的肽段,命名为DAvp-4.合成该肽段,通过表面等离子体共振技术验证了DAvp-4和B2R的结合能力,在脂多糖诱导的巨噬细胞模型及糖尿病视网膜病变小鼠模型中肯定了其抗炎作用.此研究不但获得了一个具有成药潜力的毒腺多肽,还显示了噬菌体展示技术在筛选天然产物成分研究中的有效性.