目的:研究传统中药材全蝎三种热稳定性多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的消化酶抗性.方法:结合重组表达、消化酶耐受实验、高效液相色谱技术及结构分析,评价多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的肠胃蛋白酶稳定性.结果:多肽BmKcug2 对胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶都有很好的稳定性;多肽BmKcug2-P1 对胃蛋白酶稳定性较好,对胰蛋白酶也具有一定的抗性,但对α-胰凝乳蛋白酶稳定较差;多肽Martentoxin-P2 的酶稳定性谱与BmKcug2-P1 类似.结论:本研究发现了全蝎毒腺中存在多肽能够耐受肠胃蛋白酶的消化作用,阐明了全蝎毒腺中多肽的消化酶稳定性,为深入研究全蝎中有效药用成分提供了思路,为系统研究全蝎多肽活性成分和口服给药途径之间的关系奠定了基础.

目的:通过在单细胞水平分析小鼠磨牙细胞间异质性，构建牙髓细胞发育的时空图谱，进一步揭示牙齿发育的过程和调控机制。方法:分别收集出生后0、3 d的C57BL/6小鼠下颌第一磨牙各10颗，制备单细胞悬液，采用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术进行测序。从本课题组前期研究中提取出生后7 d小鼠磨牙scRNA-seq数据，与0、3 d数据进行合并分析。使用Seurat程序对测序数据进行质控、标准化、降维和聚类分析；Monocle程序进行拟时序分析，预测发育轨迹；Scillus程序进行基因本体分析，对细胞功能进行注释。使用原位杂交技术对标记基因进行体内定位，明确不同亚群细胞的体内分布和时空变化。结果:Seurat分析显示小鼠磨牙细胞具有26个细胞亚群，可分为牙髓细胞、牙囊细胞、上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞、管周细胞、胶质细胞和红细胞等八大类细胞，其中牙髓细胞包含5个亚群：成熟牙髓细胞，标记基因为柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackie virus and adenovirus receptor，Cxadr）；牙乳头细胞，标记基因为SPARC相关模块化钙结合蛋白2（SPARC related modular calcium binding 2，Smoc2）；周期细胞，标记基因为Ⅱ型DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase Ⅱ alpha，Top2a）；前成牙本质细胞，标记基因为棕榈酰蛋白羧酸酯酶（notum palmitoleoyl-protein carboxylesterase，Notum）；成牙本质细胞，标记基因为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，Dspp）。随着牙胚发育，成熟牙髓细胞的比例逐渐增加，周期细胞和成牙本质细胞比例逐渐降低。原位杂交染色和基因本体分析结果显示，Cxadr+成熟牙髓细胞定位于牙冠上部，主要功能为成骨和“细胞外结构组织”；Smoc2+牙乳头细胞位于根尖，主要功能与“细胞外结构组织”和器官发育相关；Top2a+周期细胞位于牙冠下部，进行有丝分裂；Notum+前成牙本质细胞邻近上皮根鞘，和Dspp+成牙本质细胞的主要功能同为生物矿化。Monocle分析显示牙髓细胞有2条发育轨迹，从Smoc2+牙乳头细胞起始，经过Top2a+周期细胞，再分化为Cxadr+成熟牙髓细胞或成牙本质细胞。结论:scRNA-seq技术能在转录组水平充分揭示细胞间的异质性，为研究器官发育过程和调控机制提供了有力工具。

蛇毒已被证明具有抗炎活性,其中包含许多免疫原性弱、活性强的短肽小分子.蛇毒腺是分泌毒液的器官,含有毒素成分及调控其分泌过程的大量生物活性成分.缓激肽2型受体(B2R)参与重要的细胞内信号通路,作为炎症的调节因子成为潜在的抗炎药物开发的靶点.为了获得特异性的B2R结合肽,利用尖吻蝮蛇Deinagkistro-don acutus毒腺T7噬菌体文库对靶点B2R进行3轮生物淘选,测序获得了多个具有潜在结合能力的序列.通过序列长度、溶解性预测、稳定性预测和分子对接等一系列生物信息学分析,最终确定1个含25个氨基酸的肽段,命名为DAvp-4.合成该肽段,通过表面等离子体共振技术验证了DAvp-4和B2R的结合能力,在脂多糖诱导的巨噬细胞模型及糖尿病视网膜病变小鼠模型中肯定了其抗炎作用.此研究不但获得了一个具有成药潜力的毒腺多肽,还显示了噬菌体展示技术在筛选天然产物成分研究中的有效性.

[目的]本研究旨在克隆西方蜜蜂Apismellifera RNA m6A甲基转移酶14(methyltransferase 14,METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达模式,并制备AmMETTL14多克隆抗体,为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础.[方法]通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证.使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析,并构建系统进化树.通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白,免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性.采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮7种组织中的相对表达量.[结果]成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C1957H3113N567O589S15,分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质;西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerania、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.dorsata、小蜜蜂A.florea、欧洲 熊蜂 Bombus terrestris、金环胡蜂 Vespa mandarinia、美洲东部熊蜂 B.impatiens 和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60％)且亲缘关系最近.制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512K)且特异性较强.AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量,在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量,在6,12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量;AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量.[结论]研究结果表明,AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白,AmMETTL14在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用,制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强,为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础.

颜氏大疣蛛Macrothele yani个体大、毒性强、易取毒,是农林生态系统中害虫的重要天敌,也是天然药物研究工作者进行新药挖掘和毒液开发利用的重要选择对象.本研究利用高通量测序平台Illumina Hiseq 2000 对颜氏大疣蛛雌雄成体的毒腺进行转录组测序和生物信息学分析,共获得转录组样本数据 37.8 G,总计 301 024 条unigenes,总长度170 512 372 bp,最短 201 bp,最长 36 105 bp,平均长度 566 bp,GC含量平均值为 38.17%,N50 长度为705 bp.将unigenes序列与NR(非冗余蛋白序列数据库)、String(蛋白质相互作用数据库)、Swiss-prot(蛋白质序列数据库)、Pfam(蛋白质家族数据库)、GO(基因本体论)、KOG(真核生物蛋白质直系同源数据库)、KEGG(京都基因与基因组百科全书)数据库进行比对(e≤10-10),分别获得 31 409、6 549、11 817、8 216、11 480、7 804 条unigenes注释.通过生物信息学对雌雄颜氏大疣蛛unigenes进行表达量分析,筛选高表达量且高可信度的差异表达基因,并进行对这些差异基因进行GO和KEGG功能富集分析;与雄蛛相比,雌成体有205 条unigenes表达量上调,113 条unigenes表达量下调.最后在所有的转录本数据中共比对到 68 条毒素相关序列.本研究获得的颜氏大疣蛛转录组信息,为颜氏大疣蛛的功能基因挖掘提供了重要的信息资源.

蜂毒由工蜂毒腺和工蜂副腺分泌后贮藏于工蜂蛰针上端的毒囊中,蛰刺时蛰针上端的毒囊收缩后由蛰针排出. 蜂毒是一种混合物,其组成成分较多且较复杂,蜂毒中含有多种生物活性胺如组胺、多巴胺、5-羟色胺及去甲肾上腺素等;多种活性肽如蜂毒肽、赛卡品、安度拉平心脏肽及肥大细胞脱粒肽( MCD)等〔1〕.除了镇静止痛和抗风湿性关节炎及抗炎症与调节免疫功能的作用外,蜂毒还具有抗肿瘤作用〔2〕,本文就其抗肿瘤作用进行综述.

[目的]克隆获得中华蜜蜂Apis cerana cerana转录因子AP-1(transcription factor AP-1)基因AccAP-1序列,分析其在中华蜜蜂不同发育时期和组织中以及不同非生物应激条件下的表达差异,为该基因的功能研究提供参考.[方法]以中华蜜蜂全组织cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增克隆获得中华蜜蜂转录因子AP-1基因cDNA序列;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建中华蜜蜂转录因子AP-1与其他膜翅目昆虫同源AP-1蛋白系统发育树;通过实时定量PCR分析中华蜜蜂转录因子AP-1基因在不同发育时期(1-6日龄幼虫、预蛹、白眼蛹、红眼蛹、褐眼蛹、1日龄成年工蜂和15日龄成年工蜂)以及15日龄成年工蜂不同组织(头、肌肉、表皮、中肠、直肠和毒腺)中的mRNA表达情况;将15日龄成年工蜂分别置于极端温度(4℃,16℃和44℃)下,以及饲喂含有农药(0.01 mL/L百草枯)和重金属(1 mg/mL CdCl2)的蔗糖溶液条件下,分析目的基因mRNA的表达情况.[结果]克隆获得了中华蜜蜂转录因子AP-1基因AccAP-1(GenBank登录号:MF994311)开放阅读框(ORF)的序列,其长度为813 bp,编码270个氨基酸,预测蛋白分子量为30.24 kD,理论等电点为8.31.保守结构域分析表明,在第7-137位氨基酸之间存在一个Jun超家族的保守结构域,在第195-255位氨基酸之间存在一个bZIP_Jun超家族的保守结构域.氨基酸序列比对以及进化树结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂Apis mellifera的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果显示,AccAP-1在各发育时期表达量差异显著(P＜0.05),其中,在1日龄幼虫和15日龄成蜂期表达量最高;AccAP-1在测试的各组织中均有表达,在肌肉中的表达量最高(P＜0.05).不同非生物应激条件下的表达量分析表明,4℃低温可以诱导AccAP-1表达量显著升高(P＜0.05),16c℃处理0.5～2 h可显著提高其表达量(P＜0.05),2h后表达量逐渐降低,而44℃处理时除了在15 min时表达量显著下降(P＜0.05),其余时间点表达量差异不显著(P＞0.05);在饲喂含有百草枯的蔗糖溶液后,其表达量显著降低(P＜0.05),而CdCl2处理诱导其表达量显著升高(P＜0.05).[结论]结果提示AccAP-1基因可能参与中华蜜蜂机体抵抗外界环境压力的过程.

干燥综合征(sicca syndrome,SS)是累及多种外分泌腺体的多系统慢性炎症性自身免疫病.临床上常侵犯唾液腺和泪腺,表现为口干、眼干等一派燥象之症,也可侵犯其他器官及脏器而出现多系统损害,属于中医学燥痹的范畴,其基本病机为阴虚津亏为本,燥热瘀毒为标,瘀毒腺络为关键[1].燥邪的出现多由于禀赋不足,阴阳失调;或素体阴液亏虚,津液不足;或素体阳虚,不能化水,津液不能上承;或感受外邪,化燥化热,燥热伤阴,消灼津液;或七情内伤,久病失养等因素,导致阴液亏虚,清窍失于润养所致.SS可引起多器官、多脏腑的损害,说明不是单一的某一脏腑病变,而是涉及心、肺、肝、脾(胃)、肾等多脏腑.应旭曼教授为医学博士、杭州市西溪医院主任医师,硕士研究生导师,具备中西医双学历,浙江省中医药学会中医基础理论研究分会委员,擅长运用中药治疗风湿免疫及肾内科疑难杂症.应教授从医20余年,对于干燥综合征的治疗积累了丰富的临床经验,笔者为应教授的硕士研究生,随其侍诊,现将其五脏论治干燥综合征的经验总结如下.

通过胡蜂毒腺组织的全转录组测序技术,构建黑胸胡蜂毒腺组织cDNA的序列信息库.根据毒素蛋白质研究提供的一小段蛋白质序列,将本地Blast技术和分子克隆技术结合在一起,克隆得到黑胸胡蜂毒液蛋白磷脂酶A1的基因序列,命名为VT-1;并采用生物信息学方法,预测VT-1的蛋白质序列和三级结构.序列分析显示,VT-1蛋白质与已发现的磷脂酶A1蛋白同源,属于磷脂酶A1家族成员;结合VT-1和其它已经报道的磷脂酶A1序列,采用空间结构预测和序列比对方法发现,磷脂酶VT-1盖结构域中含有保守谷氨酸(E),在Ca2+存在下,可能增强VT-1的磷脂酶活性,提高毒性.根据磷脂酶VT-1盖结构域中谷氨酸(E)保守性,设计两个VT-1的减毒抗原.为靶向黑胸胡蜂VT-1的抗毒血清研究奠定基础.

提取海南产桶形芋螺线粒体基因组完整DNA (mtDNA),并对提取条件进行优化.以桶形芋螺腹足肌肉、毒腺和肝胰脏三个不同组织为材料,分别采用改进高盐沉淀法、细胞器/磁珠法和试剂盒提取三种方法,提取桶形芋螺mtDNA,并利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取mtDNA的纯度和浓度进行测定.以coxⅠ-rRNA小亚基基因和α-芋螺毒素基因设计引物,通过PCR反应来确证所提取的DNA确实是mtDNA.试剂盒法提取肝胰脏、高盐沉淀法提取肝胰脏和腹足肌肉组织这三种方法的产率很高,分别为44.4 μg/mg、43.3 μg/mg和32.6 μg/mg.A260/280比值表明,改进高盐沉淀法提取毒腺和腹足肌肉组织,细胞器磁珠法提取腹足肌肉组织的mtDNA纯度很高.综合比较,采用改进高盐沉淀法,利用桶形芋螺腹足肌肉组织所提取的mtDNA产率高、质量好、纯度高.高质量芋螺mtDNA的获取为利用分子生物学方法对芋螺进行遗传进化分析和系统分类提供了基础.