目的:分析广州市花都地区育龄人群常见和罕见地中海贫血(简称地贫)基因型分布情况,完善该地区的地贫基因库.方法:收集2016年1月至2022年10月在广州市花都区妇幼保健院进行地贫基因检测的全血标本,采用跨越断裂点PCR+导流杂交法检测23种常见地贫基因型,对于怀疑为罕见地贫的样本采用琼脂糖凝胶电泳、珠蛋白测序等方法进行罕见地贫基因型检测.结果:在36 412例受检者中,地贫基因阳性者共16 171例(44.41％),常见型16 057例(44.10％),罕见地贫基因型为114例(0.31％).检出常见α-地贫10 845例(29.78％),以--SEA/αα最多,-α3.7/αα次之,-α4.2/αα占第三位;检出常见β-地贫4 531例(12.44％),以β41-42/βN最多,β654/βN次之,β-28/βN占第三位;共检出α β复合型地贫基因型681种(1.87％),以--SEA/αα复合βCD41-42/βN为最多.检测出罕见α-地贫48例,14种突变型,以融合基因(Fusion gene/αα)最多见;罕见β-地贫52例,共11种突变类型,以βSEA-HPFH/βN最多见.结论:花都地区常见和罕见地贫基因型复杂多样,应该重视罕见地贫基因型的检测.

目的:回顾性分析2例合并双重罕见型地中海贫血基因型病例的检测及诊断过程,探究罕见地中海贫血的漏诊误诊原因,提高罕见地中海贫血诊断水平.方法:结合受检者家族史、血液学表型及血红蛋白电泳分析结果,采用PCR+导流杂交法检测受检者α和β-地中海贫血常见基因型,DNA测序技术对受检者标本进行罕见α和β蛋白基因测序.结果:两例受检者均为合并双重罕见地中海贫血基因型,该两例罕见地中海贫血基因组合均为首次报道,一例为αα*53_55 delTCC/αα杂合合并βIVS Ⅱ-2(-T)/βN杂合的αβ复合地中海贫血,另一例为ααIVS-Ⅱ-55(T→G) in α1/αα4,2-Q双重杂合的α-地中海贫血,其中αα*53_55 del TCC/αα基因型亦为首次报道.结论:本次报道的中国人群中罕见地中海贫血基因类型αα*53-55 del TCC/αα及两例罕见地中海贫血基因组合案例,丰富了中国人群地中海贫血基因突变谱,为地中海贫血诊断和优生优育咨询提供更丰富的分子信息.

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建SLC19A2基因敲除的纯合子小鼠模型,并验证其表型.方法 设计gRNA载体,将构建好的gRNA载体和Cas9载体进行体外转录后共注射到受精卵,经胚胎移植后获得6只(雌性3只、雄性3只)阳性F0代小鼠.通过繁育获得12只(雄性6只、雌性6只)SLC19A2基因敲除纯合子小鼠[SLC19A2-/-小鼠(C57BL/6)].8周龄野生型C57BL/6小鼠和SLC19A2-/-小鼠各12只(雄性6只、雌性6只),分别设为野生型组与基因敲除纯合子组.采用PCR扩增凝胶电泳法鉴定小鼠基因型;采用实时荧光定量PCR检测胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测胰腺组织和肝脏组织中THTR-1蛋白表达.结果 PCR扩增凝胶电泳法成功鉴定出SLC19A2-/-小鼠.基因敲除纯合子组胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA及THTR-1蛋白表达水平低于野生型组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 基于CRISPR/Cas9技术成功构建了 SLC19A2基因敲除小鼠.

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白，为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板，利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因，经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中，构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达大量蛋白，采用亲和层析方法纯化重组蛋白；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯化水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法鉴定表达产物。 结果:成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒，诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15 × 10 3处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带，且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示，纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。 结论:成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白，为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

目的:探讨结肠腺瘤性息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli, APC）基因的两个SNP位点E1317Q（rs1801166，G>C）和D1822V（rs45952，A>T）多态性与绝经后女性骨质疏松及骨代谢指标的相关性。方法:选择2019年3月至2021年3月于浙江大学医学院附属第二医院进行常规体检的374例绝经后女性作为研究对象，分为骨量正常组（103例）、骨量减少组（114例）和骨质疏松组（157例）。采用西门子公司生产的128排螺旋CT机测量骨密度；记录临床和骨代谢指标；应用毛细管电泳和片段分析（SNaPshot）技术对2个SNP位点进行基因分型。在定量实时荧光定量聚合酶链式反应系统中测定APC基因mRNA的相对表达量。结果:APC基因rs1801166和rs45952位点基因型和等位基因频率分布在三组间的差异均有统计学意义（ P均<0.05）。对于rs1801166位点，两两比较结果显示骨质疏松组的基因型分布与骨量正常组、骨量减少组间差异具有统计学意义（ P均<0.05）；等位基因频率比较在不同两组间差异均有统计学意义（ P均<0.05）；对于rs45952位点，两两比较结果显示基因型分布和等位基因频率在骨质疏松组与骨量正常组间差异有统计学意义（ P<0.05）。rs1801166位点野生型和突变型间的血钙、血磷、碱性磷酸酶、25-羟基维生素和骨密度比较差异均有统计学意义（ P均<0.05）；rs45952位点野生型和突变型间血钙、碱性磷酸酶、25-羟基维生素和骨密度比较差异均有统计学意义（ P均<0.05）。骨量正常组、骨量减少组和骨质疏松组的APC基因mRNA相对表达量两两比较差异有统计学意义（ P均<0.05）。rs1801166和rs45952位点位点野生型的APC基因mRNA相对表达量均显著低于突变型（ P均<0.05）。 结论:APC基因变异与绝经后女性骨质疏松及骨代谢指标显著相关，并可能影响基因的表达水平。

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2在大鼠急性胰腺炎胰腺组织修复重建中的作用及其可能机制。方法:114只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(对照组)、急性水肿性胰腺炎模型组(AEP组)、急性坏死性胰腺炎模型组(ANP组)、ANP对照组和ANP干预组。采用皮下注射雨蛙素法制备大鼠AEP模型，采用腹腔注射L-精氨酸法制备大鼠ANP模型，在ANP制模前30 min及制模后24、48 h腹腔注射TGF-β1抑制剂SB431542或DMSO分别制备ANP干预组和ANP对照组。采用羟脯氨酸试剂盒测定胰腺组织羟脯氨酸含量，采用免疫组织化学法检测胰腺组织TGF-β1、磷酸化Smad3(p-Smad3)、Ⅲ型胶原和MMP-2的表达，采用明胶电泳法测定MMP-2活性，采用蛋白质免疫印迹法检测胰腺组织MMP-2和p-Smad3蛋白的表达水平。结果:对照组胰腺组织羟脯氨酸含量为(61.71±8.56)μg/mg蛋白，AEP组在制模后3 d胰腺组织羟脯氨酸含量达到峰值[(116.72±8.53)μg/mg蛋白]，ANP组在制模后5 d达到峰值[(174.93±11.75)μg/mg蛋白]，ANP组羟脯氨酸峰值显著高于AEP组，AEP组峰值又显著高于对照组；ANP干预组制模后3、5、7 d羟脯氨酸含量分别为(108.07±10.48)、(137.14±8.66)、(112.35±13.16)μg/mg蛋白，显著低于ANP对照组3、5、7 d的(132.35±14.2)、(175.43±13.75)、(137.92±12.65)μg/mg蛋白。对照组、AEP组、ANP组TGF-β1免疫组织化学峰值评分分别为(0.12±0.03)、(1.96±0.21)、(3.00±0.28)分，p-Smad3分别为(0.15±0.05)、(2.05±0.20)、(3.05±0.24)分，Ⅲ型胶原分别为(0.11±0.04)、(1.56±0.15)、(3.10±0.17)分，MMP-2分别为(0.05±0.03)、(1.45±0.20)、(2.45±0.15)分，ANP组显著高于AEP组和对照组；ANP干预组和ANP对照组胰腺组织TGF-β1、p-Smad3、Ⅲ型胶原、MMP-2免疫组织化学峰值评分分别为(2.36±0.21)、(2.25±0.22)、(2.47±0.19)、(2.00±0.10)分和(3.02±0.21)、(3.01±0.19)、(3.05±0.24)、(2.43±0.11)分，ANP干预组显著低于ANP对照组。对照组、AEP组、ANP组、ANP干预组、ANP对照组胰腺组织MMP-2活性峰值分别为10.85±1.73、90.01±8.92、117.82±9.52、85.78±7.16、115.43±8.7，ANP组显著高于AEP组，AEP组又显著高于对照组，ANP干预组显著低于ANP对照组；ANP干预组及ANP对照组制模后3、5 d胰腺组织MMP-2蛋白表达量分别为0.20±0.01、1.19±0.02，0.52±0.01、1.54±0.05；p-Smad3蛋白表达量分别为0.30±0.04、0.66±0.11，1.95±0.05、1.30±0.01，ANP干预组MMP-2及p-Smad3表达水平均显著低于ANP对照组。以上各组间的差异均有统计学意义( P值均<0.01)。 结论:TGF-β1、MMP-2在急性胰腺炎炎症后组织修复重塑和细胞外基质沉积中起着重要作用。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:探讨寡克隆区带（OCB）阳性的神经型布鲁菌病（NB）患者的临床、影像学及脑脊液特点。方法:回顾性分析郑州大学第一附属医院2020年1月至2023年6月间确诊为NB的23例患者，男9例，女14例，年龄47（34，59）岁。根据血清及脑脊液IgG电泳结果将NB患者分为OCB阳性组和OCB阴性组，比较两组的临床、影像学及脑脊液特点。结果:23例NB中脑脊液OCB阳性者占65.2%（15/23），以Ⅱ型（14/15）为主；阴性组8例。OCB阳性组临床重型占比（11/15）、脑脊液白细胞计数升高占比（15/15）、IgG指数［ M（ Q1， Q3），0.97（0.57，2.11）］，24 h鞘内合成率［55.6（15.3，232.2）mg/24 h］显著高于阴性组［1/8，5/8，0.63（0.51，0.69），11.6（-1.6，17.3）mg/24 h，均 P<0.05］。两组患者在病程、临床分型上差异无统计学意义（均 P>0.05）。OCB阳性组可表现为全脑（幕上合并幕下）脑实质多发病灶（5/15），但OCB阴性组均未发现幕下脑实质受累（0/8）。 结论:NB患者OCB阳性检出率为65.2%。OCB阳性者临床重症患者更多，神经系统鞘内体液免疫炎性反应更严重，较OCB阴性组更易出现幕下脑实质受累。

目的:探讨程序性细胞死亡因子4（PDCD4）在肝癌组织中表达及其临床诊断价值。方法:选取2021年6月到2023年6月新乡医学院第一附属医院手术切除的肝癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用蛋白质组学分析肝癌组织中差异表达的蛋白；采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白质免疫印迹分析癌旁组织和肝癌组织PDCD4表达水平；采用全自动生化仪检测肝癌患者血清肿瘤标志物糖类抗原199（CA199）与甲胎蛋白（AFP）的水平；分析PDCD4表达水平与肝癌患者临床病理特征和预后的关系，并分析PDCD4与肿瘤标志物CA199与AFP的关系。制备接收者工作曲线，分析PDCD4诊断肝癌的价值。符合正态分布的计量数据比较采用独立样本 t检验。 结果:双向电泳结果显示肝癌组织和癌旁组织差异表达的蛋白54个，其中上调20个，下调24个。下调最为显著的蛋白是PDCD4。肝癌组织中PDCD4蛋白和mRNA表达水平（0.85±0.24、0.85±0.24）明显低于癌旁组织（1.57±0.29、1.06±0.26），差异均有统计学意义（ t＝18.710、17.460， P<0.05）。中高分化患者、未淋巴结转移患者PDCD4表达水平（1.09±0.16、1.17±0.23）明显高于低分化和淋巴结转移（0.74±0.13、0.75±0.15），差异有统计学意义（ t＝11.410、10.720， P<0.05）。PDCD4高表达组患者3年生存率[55.56%（30/54）]明显高于低表达组[35.56%（16/45）]，差异有统计学意义（LogRank＝5.649， P<0.05）。高表达组患者血清CA199与AFP水平[（40.67±8.23） U/ml、（55.72±14.79） μg/L]明显低于低表达组患者[（83.94±13.58） U/ml、（58.44±7.72） μg/L]，差异有统计学意义（ t＝11.570、6.990， P<0.05）。PDCD4、CA199与AFP联合诊断的曲线下面积0.850（0.724～0.985），灵敏度为0.895，特异性为0.879。 结论:肝癌患者肿瘤组织中PDCD4表达显著下调，与患者不良临床病理特征和预后相关，与血清标志物CA199和AFP联合检测有助于肝癌诊断。