目的 探究蟾毒它灵(Bufotalin)对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞HL-60铁死亡的作用及机制.方法 用不同浓度(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1)蟾毒它灵分别作用于APL细胞HL-60,使用光学显微镜观察细胞的形态学变化;采用CCK-8法检测细胞的存活率情况;采用Western blot法检测细胞中铁死亡相关蛋白CD71、xCT、FTH 1、GPX4的表达水平;采用谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测试剂盒检测细胞内GSH和GSSG的含量变化;采用脂质氧化(MDA)检测试剂盒测定细胞内MDA的含量变化.将0.5 μg·mL-1蟾毒它灵、0.1 μmol·L-1 Fer-1和0.5 μg·mL-1蟾毒它灵+0.1 μmol·L-1 Fer-1分别作用于HL-60细胞,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,并用Western blot法检测铁死亡相关蛋白的表达水平.结果 不同浓度蟾毒它灵处理HL-60细胞后,细胞形态呈现出哑铃型、梭形等不规则形状,细胞的存活率降低,且呈时间-剂量依赖关系.与对照组相比,蟾毒它灵可降低铁死亡相关蛋白GPX4、xCT、FTH 1的表达水平和总谷胱甘肽的含量(均P＜0.01),升高CD71蛋白的表达水平和MDA含量(均P＜0.05).蟾毒它灵与铁死亡抑制剂Fer-1联合处理HL-60细胞后,与对照组比较,HL-60细胞的生长数量和形态学无明显变化,CD71、xCT、FTH1、GPX4蛋白表达水平的差异也无统计学意义(均P＞0.05).结论 蟾毒它灵可抑制APL细胞HL-60的增殖并诱导铁死亡,其可能通过GPX4介导的抗氧化途径和铁代谢途径实现.

目的 基于网络药理学结合指纹图谱与多元统计分析预测蟾皮质量标志物.方法 基于文献分析定位蟾皮质量标志物范围来源,通过网络药理学筛选蟾皮中药效相关成分,结合指纹图谱和多元统计分析筛选出影响蟾皮批次间差异性成分,将药效成分与特征差异性成分关联,预测质量标志物,并进行分子对接验证和含量测定.结果 蟾皮质量标志物为沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛,能与主要抗肿瘤靶点稳定结合,其含量在多批次样品间具有一定差异,其中沙蟾毒精、蟾蜍噻咛整体较高,华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基整体较低.结论 沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛为蟾皮抗肿瘤作用的质量标志物.

目的 基于网络药理学和分子对接研究华蟾素治疗胃癌的作用机制.方法 通过药物靶点预测网站获得华蟾素成分靶点,疾病数据库获取胃癌疾病基因,将两者共同靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路分析,Cytoscape软件构建蛋白互作(PPI)网络和药物-靶点-疾病相互作用网络.通过Kaplan-Meier分析关键靶点与胃癌预后的相关性,分子对接分析华蟾素成分与关键靶点的结合情况,最后筛选出核心靶点,并通过TCGA、GEO数据库进行单因素、多因素Cox回归分析以验证其与胃癌预后的关系.结果 华蟾素治疗胃癌涉及 70 个靶点、1 399个生物学过程、75 个分子功能、145 条信号通路,通过药物-靶点-疾病相互作用网络筛选出关键化合物 5 个、关键靶点 10 个,其中与胃癌预后相关的有 7 个.华蟾素主要成分与胃癌关键靶点间有较好的结合活性,核心靶点为EGFR、MAPK3、ALB,与胃癌预后密切相关.结论 华蟾素治疗胃癌的关键成分为华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒灵,它们可能通过多靶点、多途径来发挥作用.

蟾酥作为临床常用的动物药材,广泛用于心血管疾病、风湿和恶性肿瘤疼痛的治疗.因其具有高活性和高毒性的特点,关注蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制,对于保障临床用药的安全有效至关重要.通过梳理我国药品标准收载的蟾酥制剂情况,明确已批准上市的蟾酥制剂有 102 种 474 个批号,其中《中国药典》2020 年版收载 14 种,《中华人民共和国卫生部药品标准》收载 68 种.这些制剂中,蟾酥多以原粉入丸、散剂,功能主治主要集中在清热解毒、消肿止痛、益气活血、开窍醒脑等方面.除了 2020 年版《中国药典》收载的蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制水平相对较高以外,其他蟾酥制剂中蟾酥药味的质控标准均较低,甚至缺失,亟需进行蟾酥制剂的质量标准提升研究.进一步检索中国知网(CNKI)、PubMed、Web of Science,对国内外报道的蟾酥制剂的质量评价研究和质量控制现状进行归纳总结,有 64 种蟾酥制剂报道了定性定量分析方法,主要有薄层鉴别、HPLC指纹图谱和多成分含量测定,指标成分涉及日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基等主要的蟾蜍甾类成分.综合文献信息,提示在完善蟾酥制剂质量标准过程中,需要关注蟾酥药材、饮片和制剂分析方法和检测指标的关联性,加强吲哚生物碱类成分的监控,以及重视含量均匀度检查等项目,以提升蟾酥制剂的整体质量控制水平.

目的 挖掘能催化蟾蜍内酯类化合物特异性羟化修饰的酶,以促进名贵中药材蟾酥功效组分的开发与应用.方法 采用同源序列比对挖掘藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)中的甾体羟化酶,通过毕赤酵母异源表达、工程菌株细胞转化以及代谢产物的分离与鉴定,从而确定酶的功能.结果 以蟾蜍内酯类化合物蟾毒它灵、蟾毒灵为底物,毕赤酵母重组菌株KM71H-FF294转化蟾毒它灵没有产生明显的产物,而转化蟾毒灵时产生了羟化产物7β-羟基蟾毒灵.结论 从藤仓赤霉菌中发现能催化蟾毒灵发生7β-羟化修饰的甾体羟化酶FF294,是目前文献报道首个能催化蟾蜍内酯类化合物羟基化反应的酶.

目的 建立超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法快速定性定量检测中毒患者食用剩余蟾蜍皮中8种蟾蜍毒素.方法 样品经甲醇提取后,待测液经过A CQUITY UPLC? HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)分离,以0.1％甲酸水溶液为流动相A、甲醇为流动相B进行梯度洗脱,流速0.3mL/min,柱温35℃,进样量2 μL,经ESI正离子模式采集.结果 在10.0～1 000.0 μg/L范围内8种毒素线性关系良好,r2r均≥0.990;检出限为0.7～2.1 μg/kg,定量限为2.5～7.0 μg/kg;三水平加标平均回收率均≥75.79％,相对标准偏差(RSD)均≤9.84％.样品中检测出蟾毒灵、去乙酰华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、伪异沙蟾毒精、蟾毒它灵,含量分别为123.8±3.1、5 920.4± 1.9、680.7±3.2、671.6±9.1、1 796.6±74.9 μg/kg,和蟾蜍他灵、华蟾毒精与华蟾毒它灵均未检出.结论 该方法同时测定蟾蜍毒素中华蟾毒精、蟾毒灵、伪异沙蟾毒精、蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒它灵、去乙酰华蟾毒精、和蟾蜍他灵、华蟾毒它灵,有较强实用性、快速、可靠.

目的 考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化.方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制5种不同肿瘤细胞株增殖的效果.结果 5种不同加工炮制方法所得蟾酥,性状有较大差异;化学成分的种类及含量没有明显差异;华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和都符合《中国药典》2015年版标准,大于6％;50℃和80℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果.结论 日晒及50℃鼓风干燥法所得蟾酥符合《中国药典》要求的外观性状.真空干燥和冷冻干燥虽然颜色不符合《中国药典》的规定,但主要有效成分并未发生较大变化.

目的:研究不同产地、不同生长年限的蟾蜍类药材质量均一性.方法:用高效液相色谱法测定12份蟾蜍类药材样品中蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基,4种指标成分含量.结果:各样品中均可检测出4种指标成分,不同产地蟾酥、干蟾、蟾衣药材间品质差异较大;干蟾样品中4种指标成分含量,小的干蟾个体明显高于大的干蟾个体样品;蟾衣样品中,脂蟾毒配基含量:蟾衣(大)<蟾衣(小),蟾毒灵含量:蟾衣(小)<蟾衣(大).结论:本实验为合理开发、应用蟾蜍类药材资源提供理论和实验依据.

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanostictus耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物.目前商品蟾酥质量问题突出,混伪、掺假现象普遍存在.亟需构建科学完善的质量控制方法,以提升蟾酥药材、饮片及其中成药制剂的质量控制水平,保障临床用药安全有效.该研究采用高效液相色谱法建立蟾酥药材的特征图谱,采用一测多评法(QAMS)测定5种主要蟾毒配基的含量.通过不同批次市售蟾酥样品的分析,建立了以五羟色胺、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为特征峰的对照特征图谱;建立了以华蟾酥毒基为内参物,同步测定蟾酥药材中5种蟾毒配基含量的一测多评法,并对相对校正因子(RCF)的耐用性和系统适用性进行了系统研究.华蟾酥毒基对日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基的RCF分别为1.05,0.895,1.09,0.913.建立的特征图谱和QAMS法,可以有效控制蟾酥药材的质量,为2020年版《中国药典》蟾酥药材质量标准的完善与提高提供参考.

蟾毒它灵是从蟾酥中提取的化合物,属于蟾蜍二烯酸内酯,它不仅有抗心律失常、强心、抗菌、局部麻醉、解热、利尿等作用,并且对许多实体肿瘤和非实体肿瘤也有很好的抑制作用.蟾毒它灵诱导肿瘤细胞凋亡的机制主要与线粒体途径、死亡受体途径及内质网应激有关,本文就蟾毒它灵诱导肿瘤细胞凋亡分子机制的研究现状进行综述.