目的:建立咪喹莫特(imiquimod，IMQ)诱导小鼠慢性银屑病样皮炎模型，探讨补体C5a/C5aR1通路在该病理过程中的作用及机制。方法:IMQ涂抹(每2天1次，共8次)小鼠背部皮肤建立慢性银屑病样皮炎模型。比较BALB/c(C5aR1 +/+)及C5aR1基因敲除(C5aR1 －/－)小鼠皮炎程度及病理改变；免疫组化(immuohistochemistry, IHC)检测皮损组织表皮细胞增殖(Ki67)、角蛋白K6/K14表达及中性粒细胞浸润(Ly-6G)情况；实时荧光定量PCR(qPCR)检测皮损组织角蛋白K6/K14及炎症因子表达。流式细胞术检测皮损局部炎症细胞浸润及IL-17A应答。 结果:IMQ可诱导银屑病皮炎典型表型，如银屑、红斑及皮肤增厚。HE染色提示表皮角质细胞异常增殖、棘皮症、微脓肿、炎症细胞浸润及真皮毛细血管异常增生。与C5aR1 +/+小鼠比较，C5aR1 －/－小鼠皮炎表型明显减轻，角质细胞异常增殖、角蛋白K6/K14表达及中性粒细胞浸润显著降低；qRCR检测同样发现C5aR1 －/－小鼠角蛋白K6/K14、炎症因子(IFN-γ、MIP-1α、IL-1β和TNF-α)及IL-17应答相关细胞因子(IL-6、IL-17A和IL-23)表达明显下调。此外，C5aR1 －/－小鼠皮损组织白细胞(CD45)、T细胞(CD3)及IL-17A +γδTCR +T等浸润显著减少；C5aR1 －/－小鼠腋窝引流淋巴结及IL-17A +细胞、IL-17A + CD3 +T和IL-17A + γδTCR + T比例显著降低。 结论:本研究成功建立了小鼠慢性银屑病样皮炎模型，补体C5a/C5aR1通路可能激活IL-17产生细胞发挥作用，阻断该通路有望成为银屑病治疗的新策略。

目的 探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响.方法 分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因.Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况.将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17～19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50 000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40nnmol/L,每孔500 μ1)的组别.经4％多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜,加入绿色IFKine?荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4 ℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况.取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BU6小鼠,为CVF组;并设置C3-/组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BU6小鼠).取10 000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示.以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)10只、C3aR-/-小鼠10只;1 000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR-/-小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1 000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BU6小鼠)6只和C5aR-/-小鼠6只,感染后3d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止.采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析.正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验.结果 PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81 细胞株内扩增出 C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和 C5aR(374 bp)基因.Western blotting 检测结果发现,两种细胞均有 C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达.激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达.约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P＞0.05).约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR-/-小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR-/-小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05).约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre+/+C5aRflox/flox小鼠和C5aR-/-小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响.

目的:探讨补体C5a受体拮抗剂PMX205的体外抗炎作用.方法:MTT法检测PMX205对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的毒性.RAW264.7与牙龈蛋白酶(gingipain,G)体外共培养模拟炎症环境,观察PMX205的抗炎效果.实验分为6组:阴性对照组、G组、G+PMX205 (0.1、1、5、10 mg/L)组,24 h后qRT-PCR、ELISA法检测M1型巨噬细胞标志性细胞因子IL-6及TNF-α,M2型标志性细胞因子IL-10和TGF-β1;流式细胞术检测M1型标志性分子CD86及M2型标志性分子CD206.结果:MTT结果显示,PMX205对RAW264.7活力影响较小.qRT-PCR及ELISA结果显示,G组IL-6和TNF-α表达水平较阴性对照组增加;G+ PMX205各浓度组的IL-6和TNF-α的表达水平较G组减少,TGF-β1和IL-10表达水平均较G组增加(P＜0.01或P＜0.05).流式细胞术结果显示,G组CD86阳性率增加,CD206阳性率下降,G+PMX205组较G组CD86下降,而CD206增加.结论:在体外细胞模型实验中PMX205具有良好的抗炎作用.

目的 探讨补体C5a受体1(C5aRl)拮抗剂对小鼠上行性泌尿道感染的保护作用.方法 (1)雌性C57BL/6小鼠被随机分为实验组与对照组,每组各38只,采用尿道插管推注大肠杆菌(E.coli)法制作上行性泌尿道感染模型.实验组于造模前2h或造模后3h给予腹腔注射C5aR1拮抗剂(W54011或PMX53);对照组给予生理盐水或多肽.分别于感染后24h、48 h评估小鼠膀胱和肾脏感染情况:平板涂布法检测膀胱及肾组织细菌量;实时定量PCR法检测肾脏各炎性因子mRNA的表达;HE染色检查肾组织炎性细胞浸润及损伤程度.(2)原代培养肾小管上皮细胞,随机分为拮抗剂组和对照组,细胞实验检测和比较两组肾小管上皮细胞的细菌黏附量.结果 与对照组相比,造模前给予C5aR1拮抗剂的W54011亚组和PMX53亚组小鼠,感染后48 h膀胱和肾组织细菌量降低(均P＜ 0.01);W54011亚组小鼠肾组织病理评分降低(均P＜ 0.05);感染后24 h肾脏炎性因子,包括:趋化因子(C-X-C序列)配体1(CXCL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达降低(均P＜0.05).与对照组相比,造模后给予C5aR1拮抗剂的PMX53亚组小鼠,感染后48 h膀胱和肾组织细菌量降低(均P＜ 0.01).细胞实验结果显示,与对照组比较,W54011组和PMX53组黏附于细胞上的细菌量减少(均P＜ 0.05).结论 C5aR1拮抗剂可改善泌尿道感染组织病理改变,减轻肾脏炎性反应和减少黏附于肾小管上皮的细菌量.C5aR1可能成为预防及治疗泌尿道感染的有效靶点.

目的：探讨儿童过敏性紫癜性肾炎（HSPN）的病理特点、病理评分分级与临床表现的关系。方法收集安徽省儿童医院肾内科2004年1月至2014年3月期间确诊为 HSPN 的77例患儿临床、病理资料，对其病理特点和临床表现进行回顾性分析。结果77例 HSPN 患儿中，腹型2l 例（27.3％）、关节型15例（19.5％），同时有关节及胃肠道症状28例（36.4％），无关节及胃肠道症状13例（16.9％）。单纯性血尿或单纯性蛋白尿21例（27.3％），血尿和蛋白尿37例（48.1％），肾病综合征型18例（23.4％），慢性肾炎型1例（1.3％）。肾脏病理分级中，Ⅰ级5例（6.5％）、Ⅱ级36例（46.8％）、Ⅲ级35例（45.5％）、Ⅳ级1例（1.3％）。HSPN 临床症状的严重程度与病理分级有相关性（rs ＝0.472，P ＝0.000）；蛋白尿症状明显者，病理级别较高。根据肾小球内沉积的免疫复合物不同可分为6型，以 IgA + IgM 沉积最多[48例（62.3％）]，其次为 IgA +IgG + IgM 沉积型[15例（19.5％）]；单纯 IgA 沉积11例（14.3％），IgA + IgG 沉积1例（1.3％），单纯 IgM 沉积者1例（1.3％），无 Ig 沉积者1例。其中伴补体 C3沉积59例（76.6％）。病理分级表现为Ⅲ级及以上者多见，有32例（54.2％），Ⅱ级25例（42.4％），Ⅰ级2例（3.4％）。不同免疫复合物沉积类型之间在病理类型的分布上差异无统计学意义，但补体 C3沉积与病理分级呈正相关（rs ＝0.361，P ＝0.001）。肾小球评分分级中，1级者62例（80.5％）、2级者15例（19.5％）；不同临床分组的肾小球评分分级不同，差异有统计学意义（χ2＝17.2，P ＝0.004）。77例（100％）患儿肾小管间质评分分级均为1级。结论 HSPN 患儿尿蛋白的严重程度、肾组织补体 C3沉积与病理分级相关，肾小球评分分级能较为准确地反映 HSPN 肾损害。

目的 对密枝圆柏Juniperus convallium进行化学成分和抗补体、抗氧化活性研究.方法 采用正相硅胶、ODS-C18、Sephadex LH-20以及制备型HPLC等方法进行分离纯化,结合理化性质和波谱数据鉴定化合物结构,采用细胞溶血法测定经典、旁路途径的抗补体活性及作用靶点,DPPH、ABTS、FRAP法研究抗氧化活性.结果 从密枝圆柏醋酸乙酯部位分离鉴定了17个化合物,包括黄酮类化合物9个:穗花杉双黄酮(1)、柏木双黄酮(2)、柏木双黄酮葡萄糖苷(3)、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(4)、芹菜素(5)、山柰酚-3-O-(6"-O-E-肉桂酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、槲皮素-3-O-β--D-葡萄糖苷(7)、槲皮素吡喃鼠李糖苷(8)和海波拉亭-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9);木脂素类化合物3个:异马尾松脂苷B (10)、异落叶松脂素-2a-O-β-D-葡萄糖苷(11)和异落叶松脂素-3a-O-β-D-葡萄糖苷(12);萜类化合物3个:柳叶二醇(13)、3β-羟基山达海松酸(14)和(1R,3R,4aR,4bS,7R,10aR)-7-乙烯基-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-十二氢-3-羟基-1,4a,7-三甲基-1-菲甲醇(15);以及大丁苷元(16)和β-谷甾醇(17).除16外,不同类型化合物对补体系统都显示了一定程度的抑制活性,经典途径50％抑制溶血所需浓度(CH50)为0.05～3.99 mmol/L,旁路途径50％抑制溶血所需浓度(AP50)为0.58～19.13 mmol/L,其中,黄酮类化合物尤其是双黄酮类,是密枝圆柏中重要的抗补体活性成分,并且酚羟基和糖苷基团是影响其抗补体活性的重要因素.仅羟基基团较多的黄酮类(1～3、5～9)和木脂素类(10～12)化合物显示不同程度的抗氧化活性.结论 所有化合物均为首次从密枝圆柏中分离得到,黄酮及木脂素类是其抗补体和抗氧化的主要活性成分,且显示出一定的构效关系,为密枝圆柏药效物质基础及质量控制研究提供了依据.

目的 研究肾癌荷瘤小鼠组织中补体C5a/C5aR通路活化与肿瘤高凝状态的关系及其机制.方法 收集2016年7月至2019年10月于唐山市人民医院收治的32例经病理学活检确诊的肾癌患者的癌组织和癌旁组织.采用Western印迹法检测组织中C5a/C5aR通路活化相关蛋白表达情况.于BALB/c-nu/nu裸鼠前肢腋窝皮下接种人ACHN肾癌细胞株,接种成功后随机分为干预组、 模型组,其中干预组尾静脉注射C5a联合C5aR阻断剂(C5aR antagonist,C5aRA),模型组等体积注射生理盐水,另取6只空白小鼠作为对照组.观察小鼠肿瘤生长情况,检测高凝状态相关指标水平.脱颈处死小鼠,收集癌组织,采用Western印迹法检测组织中C5a/C5aR通路活化相关蛋白表达情况.结果 两组小鼠肿瘤体积于荷瘤6～21 d差异具有统计学意义,且干预组的肿瘤体积明显低于模型组(P<0.05).3组小鼠于荷瘤第1天的血清D-D、vWF、TF水平差异无统计学意义,荷瘤第14天、 第21天干预组、 模型组血清凝血指标水平明显增加,其中干预组均明显低于模型组(P<0.05).干预组癌组织中C5aR、C5b-9、FGL2、P38、p-P38的表达水平均明显低于模型组(P<0.05).肾癌患者癌组织中C5aR、C5b-9、FGL2、P38、p-P38的表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05).32例肾癌患者中高凝状态患者14例,非高凝状态患者18例,高凝状态组癌组织中C5aR、C5b-9、FGL2、P38、p-P38的表达水平均明显高于非高凝状态组(P<0.05).结论 补体C5a/C5aR通路可通过调控FGL2的表达而诱导肾癌的高凝状态,进而参与肾癌的发病过程.

目的 探究丹酚酸A(Salvianolic acid A,SAA)对心肌梗死(myocardial infarction,MI)小鼠心脏的血小板募集、活化及中性粒细胞的影响.方法 将C57BL/6小鼠随机分为:假手术组、MI模型组、SAA(5、10 mg·kg-1)组、替罗非班(tirofiban,0.87 mg·kg-1)组,尾静脉注射给药3 d.超声心动、HE染色检测小鼠心功能及梗死面积;采用IHC、FCS、ELISA、Western blot等方法探讨了SAA抑制血小板及中性粒细胞活化作用.结果 与MI组相比,SAA可以改善MI小鼠的心功能及心脏病理变化;减少心肌组织中CD42c及外周血中CD62p的表达,同时不影响尾出血时间;降低ADP诱导的血小板活化,上调p-VASP/VASP比值,降低p-PI3K/PI3 K和p-AKT/AKT比值;减少心肌组织中CD45、Ly6 G以及CXCL1和CXCL2表达;减少心肌组织中补体成分C3aR的表达,降低C3a诱导的NE、MPO、MMP9、LF的水平.结论 SAA具有通过抑制PI3K/AKT、VASP通路发挥抗血小板活化的作用,以及通过抑制C3 aR及C3 a的表达发挥抗中性粒细胞活化的作用.

目的 探究抗补体5a受体(C5aR)抗体对变应性鼻炎(AR)大鼠调节性T细胞(Treg)/辅助T淋巴细胞17(Th17)免疫失衡的调控作用及机制初探.方法 60只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、抗C5aR抗体组、抗C5aR抗体+Jagged1组,每组15只,除对照组外,其余各组大鼠均用卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)3]致敏法建立AR模型.造模成功后,抗C5aR抗体组腹腔注射10 mg/kg抗C5aR抗体,抗C5aR抗体+Jagged1组腹腔注射10 mg/kg抗C5aR抗体和5μL的10μg/mL Jagged1钛,对照组和模型组注射等体积的生理盐水,每周注射1次,持续4周.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清免疫球蛋白E(IgE)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-6、IL-10和IL-17水平,HE染色和PAS染色观察鼻腔黏膜组织嗜酸性粒细胞与杯状细胞数目,免疫组织化学染色检测Notch1表达,Western blot检测RORγt、Foxp3、Notch1及Jagged1蛋白表达,流式细胞术检测外周血Treg和Th17亚群比例.结果 各处理组大鼠建模后表观行为学评分明显高于对照组(P<0.05);与对照组比较,模型组血清中IgE水平升高,IFN-γ、IL-10水平下降,IL-6、IL-17水平升高,鼻腔黏膜组织中嗜酸性细胞粒数目和杯状细胞数目增加,RORγt蛋白表达上调,Foxp3蛋白表达则下调,Th17细胞比例增加,Treg细胞比例减少,Th17/Treg比值上升,Notch1与Jagged1蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,抗C5 aR抗体组血清IgE水平下降,IFN-γ、IL-10水平升高而IL-6、IL-17水平下降,鼻腔黏膜组织中嗜酸性细胞粒数目和杯状细胞数目减少,RORγt蛋白表达下调、Foxp3蛋白表达上调,Th17细胞比值减少,Treg细胞比例增加,Th17/Treg比例降低,Notch1与Jagged1蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05);而相较于抗C5aR抗体组,经过抗C5aR抗体与Jagged1肽作用的大鼠,各检测指标改善情况又受到明显抑制,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 抗C5aR抗体可改善AR大鼠的症状,并且可调节机体内Treg/Th17免疫平衡,抑制Notch1-Jagged1信号途径的激活.

目的 探讨补体C5a/C5aR1通过促γδT细胞IL-17A表达介导咪喹模特(IMQ)诱导小鼠银屑病样皮炎的作用及机制.方法 建立IMQ诱导银屑病样皮炎模型小鼠,比较C5aR1+/+及C5aR1-/-小鼠银屑病样皮炎程度.免疫组化(IHC)检测皮损组织局部T细胞(CD3)及中性粒细胞(Ly-6G)浸润,炎性因子IL-17A和TNF-α的表达.流式细胞测量术(FCM)检测腋窝引流淋巴结及皮损局部IL-17A表达及其主要来源细胞亚群.C5aR1a阻断C5a/C5aR1通路后,检测IMQ诱导银屑病皮炎程度、IL-17A表达情况.此外,分离小鼠脾脏淋巴细胞,经C5a、IL-23及C5aR1a等体外刺激后,检测γδ-T细胞IL-17A表达.结果 在IMQ诱导银屑病样皮炎模型小鼠中,C5aR1--小鼠皮损表型较C5aR1+/+小鼠明显减轻,并伴有T细胞及中性粒细胞浸润减少,炎性因子IL-17A和TNF-α 表达明显下调(P<0.05).FCM检测发现C5aR1--小鼠腋窝引流淋巴结及皮损组织局部IL-17A+细胞频率显著减低,IL-17A主要由 γδCD3+TCR+T细胞分泌.C5aR1a阻断C5a/C5aR1通路后IMQ诱导银屑病皮炎程度及IL-17A表达明显下调(P<0.05).此外,C5aR1a显著下调C5a+IL-23诱导的γδT细胞IL-17A表达.结论 补体C5a/C5aR1通路促γδT细胞IL-17A表达介导咪喹模特诱导小鼠银屑病样皮炎.特异性阻断该通路有望成为银屑病治疗的新靶点.