目的:探讨穗花杉双黄酮(AF)在体外和体内对肺腺癌细胞的影响及其作用机制。方法:细胞实验选用人肺腺癌细胞株H1299(购自美国典型菌种保藏中心)，设立对照组、AF 5 μmol/L组和AF 10 μmol/L组，采用克隆平板、细胞周期分析、赫斯特染色(Hoechst)、蛋白质印迹法(Western blot)等检测AF对肺腺癌细胞的影响。动物实验选用BALB/c雄性8周龄小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)，皮下注射H1299，设立对照组、AF 20 mg/(kg·d)组和AF 40 mg/(kg·d)组，通过比较肿瘤组织体积、重量及原位末端标记法检测AF对肺腺癌细胞的影响。同位素定量分析发现差异蛋白是磷酸酶2A抑制因子(CIP2A)，在上述实验的同时用Western blot检测CIP2A蛋白表达；经过转染构建CIP2A低表达和CIP2A过度表达细胞，分别设立AF 10 μmol/L组、CIP2A过度表达＋AF 10 μmol/L组和CIP2A低表达＋AF 10 μmol/L组，用赫斯特染色(Hoechst)＋流式细胞仪检测各组的细胞增殖和凋亡。两样本均数间的比较采用 t检验。 结果:细胞实验中肺腺癌细胞增殖百分比AF 5 μmol/L组[(75.12±3.11)%， t＝9.638， P<0.01]、AF 10 μmol/L组[(58.01±4.02)%， t＝11.382， P<0.01]低于对照组[(100.02±8.11)%]；细胞G 0/G 1期百分比AF 5 μmol/L组[(55.23±2.21)%， t＝6.928， P<0.01]、AF 10 μmol/L组[(65.33±3.23)%， t＝10.132， P<0.01]高于对照组[(47.12±3.32)%]；肺腺癌细胞凋亡百分比AF 5 μmol/L组[(12.38±0.51)%， t＝26.583， P<0.01]、AF 10 μmol/L组[(21.88±0.95)%， t＝43.709， P<0.01]低于对照组[(2.29±0.13)%]；CIP2A蛋白表达AF 5 μmol/L组(0.72±0.02， t＝9.782， P<0.01)、AF 10 μmol/L组(0.49±0.03， t＝19.816， P<0.01)低于对照组(1.00±0.02)。动物实验中肿瘤体积实验组低于对照组( P<0.05)；肿瘤重量AF 20 mg/(kg·d)组[(438.33±30.40) mg， t＝19.036， P<0.01]、AF 40 mg/(kg·d)组[(255.83±24.58) mg， t＝60.782， P<0.01]低于对照组[(810.83±30.40) mg]；肿瘤组织中CIP2A蛋白表达AF 20 mg/(kg·d)组(0.60±0.03， t＝31.529， P<0.01)、AF 40 mg/(kg·d)组(0.43±0.03， t＝40.613， P<0.01)低于对照组(1.00±0.01)；原位末端标记法显示AF明显增加肿瘤细胞的凋亡。CIP2A低表达＋AF 10 μmol/L组(0.49±0.03， t＝8.012， P<0.01)抗增殖活性强于AF 10 μmol/L组(0.60±0.03)；CIP2A低表达＋AF 10 μmol/L组(28.06±0.89， t＝17.663， P<0.01)促凋亡活性强于AF 10 μmol/L组(22.02±0.73)；CIP2A过度表达＋AF 10 μmol/L组(0.80±0.05， t＝10.484， P<0.01)抗增殖活性弱于AF 10 μmol/L组(0.58±0.04)；CIP2A过度表达＋AF 10 μmol/L组(8.13±0.68， t＝37.165， P<0.01)促凋亡活性弱于AF 10 μmol/L组(22.02±0.73)。 结论:AF对肺腺癌细胞有抑制生长、促进凋亡作用，AF可能通过CIP2A来发挥作用。

目的 探讨穗花杉双黄酮(AF)对哮喘幼年大鼠气道炎症的影响并初步探讨其机制.方法 采用腹腔注射联合雾化吸入卵白蛋白(OVA)法诱导幼年SD大鼠建立哮喘模型,将大鼠随机分为哮喘模型(M)组、地塞米松(DXMS)组、AF低(AF L)、中(AF M)、高(AF H)剂量组和正常对照(CT)组.给药结束后,无创肺功能仪检测气道反应性,通过吉姆萨(Giemsa)染色分析支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞类型并计数,使用苏木素-伊红(HE)染色评价肺组织和支气管组织病理特征,酶联免疫吸附剂实验(ELISA)检测血清炎症因子的含量,Western blot检测肺组织GMP-AMP合酶(cGAS)、干扰素基因刺激物(STING)、磷酸化-干扰素调节因子3(p-IRF3)和干扰素调节因子3(IRF3)蛋白表达.结果 与CT组相比,M组幼年大鼠肺组织和支气管组织可见明显病理损伤,气道反应性、肺组织、支气管组织病理评分、BALF中炎性细胞总数及单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量显著增加、血清炎症因子以及肺组织cGAS、STING、p-IRF3/IRF3蛋白表达显著增加(P<0.05);与M组相比,DXMS和高剂量AF治疗哮喘大鼠后肺、支气管组织病理损伤缓解,气道反应性、肺组织、支气管组织病理评分、BALF中炎性细胞总数显著降低、血清炎症因子以及肺组织cGAS、STING、p-IRF3/IRF3蛋白表达明显降低(P<0.05).结论 AF可缓解哮喘幼年大鼠的气道炎症,其可能是通过抑制cGAS-STING信号通路实现的.

目的:研究贡山三尖杉Cephalotaxus lanceolata K.M.Feng的化学成分.方法:利用硅胶、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、MCI gel、RP-C18 等柱色谱方法进行化合物的分离纯化,根据理化性质和波谱方法进行结构鉴定.结果:从贡山三尖杉枝叶中分离得到 30 个化合物,分别鉴定为:三尖杉碱(1)、高三尖杉酯碱(2)、氧桥三尖杉碱(3)、诸葛菜碱D(4)、芹菜素(5)、槲皮素(6)、柯伊利素(7)、木犀草素(8)、芦丁(9)、牡荆素(10)、6-C-methylnaringeninp(11)、芹菜素-6-C-β-L-吡喃阿拉伯糖-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(12)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯(13)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(14)、穗花杉双黄酮-7-甲醚(15)、金松双黄酮(16)、银杏双黄酮(17)、熊果酸(18)、2α-hydroxyursolic acid(19)、常春藤皂苷元-28-O-β-D-葡萄糖酯苷(20)、邻苯二甲酸-二(2-乙基-己基)酯(21)、硬脂酸(22)、单棕榈酸甘油酯(23)、巨豆-7-烯-3β,4α,9-三醇(24)、肌苷(25)、腺苷(26)、甘露醇(27)、二十九烷-15-醇(28)、β-谷甾醇(29)、胡萝卜苷(30).结论:其中,化合物 4、11～14、20、21、24～26 为首次从该属植物中分离得到,化合物 8～10、15～17 为首次从该植物中分离得到.

目的 观察研究穗花杉双黄酮(AMF)在体外对人胃癌细胞株增殖、侵袭、迁移、粘附的影响,并探讨其作用机制.方法 选择BGC-823 人胃癌细胞株进行相关试验,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测AMF对BGC-823 细胞增殖的影响,Transwell侵袭试验观察AMF对BGC-823 细胞侵袭的影响,细胞划痕试验观察AMF对BGC-823 细胞迁移的影响,细胞粘附试验观察AMF对BGC-823 细胞粘附能力的影响,并采用Western bol法检测AMF对与BGC-823 细胞侵袭、迁移、粘附相关的基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9 及伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)表达,以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表达的影响.结果 MTT试验结果显示,50、100、200、400 μmol/L浓度的AMF对BGC-823 细胞增殖均有抑制作用,与 1‰二甲基亚砜(DMSO)组及空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),且随AMF浓度的增加抑制率逐渐升高,呈现浓度依赖性关系(P＜0.05).Transwell侵袭试验结果显示,与空白对照组相比,AMF 100、200、400 μmol/L浓度组侵袭过去的细胞数目均明显低于空白对照组(P＜0.05),且随AMF浓度的增加侵袭细胞数目逐渐减少(P＜0.05),呈显浓度依赖关系.细胞划痕试验结果显示,与空白对照组相比,AMF 100、200、400 μmol/L浓度组迁移至划痕区域内的BGC-823 细胞数目均少于空白对照组(P＜0.05),且随着AMF浓度增加迁移细胞数目逐渐减少(P＜0.05),呈浓度依赖关系.细胞粘附试验结果显示,AMF 100、200、400 μmol/L浓度组的AMF作用于BGC-823 细胞20、40、60、80 min后,各浓度组在各时间点粘附于纤维粘连蛋白(FN)胶上的细胞数均低于空白对照组(P＜0.05),且随着AMF浓度的增加,细胞粘附抑制率越大,随着作用时间的增加,细胞粘附抑制率亦越大,呈浓度、时间依赖关系(P＜0.05).Western bolt条带分析显示,与空白对照组比较,AMF 100、200、400 μmol/L浓度组的RECK蛋白表达量均高于空白对照组(P＜0.05),MMP-2 及MMP-9 蛋白表达量均低于空白对照组(P＜0.05),且随着AMF浓度的增加RECK蛋白表达量明显增高,MMP-2 及MMP-9 蛋白表达量明显降低,呈浓度依赖关系(P＜0.05);与空白对照组比较,AMF 100、200、400 μmol/L 浓度组的 p-Akt 及p-PI3K蛋白表达量均低于空白对照组(P＜0.05),且随AMF浓度的增加表达量明显降低,呈浓度依赖关系(P＜0.05).结论 AMF能抑制BGC-823 人胃癌细胞株的增殖、侵袭、迁移、粘附能力,其机制可能与促进RECK蛋白表达,下调MMP-2 及MMP-9 蛋白表达,并抑制PI3K及Akt蛋白磷酸化从而抑制PI3K/Akt信号通路表达有关.

目的:研究江南卷柏药材与混淆品旱生卷柏、兖州卷柏的性状与HPLC特征图谱的区别,为江南卷柏和近缘种的鉴定寻找解决方案.方法:观察比较江南卷柏与混淆品的性状特征.采用HPLC法,利用相似度软件计算其HPLC谱图的相似度,选择具有鉴别意义的指纹区,以穗花杉双黄酮色谱峰为参照,计算色谱峰相对保留时间,建立特征图谱,采用HPLC-DAD-ESI-MS/MS指认江南卷柏特征图谱的化学成分,并与其近缘种图谱进行比较.结果:江南卷柏、旱生卷柏、兖州卷柏具有其专属的性状特征.HPLC特征图谱方法学考察良好,10批江南卷柏样品的相似度为0.871～0.985,具有稳定的共有峰.江南卷柏特征图谱中13种黄酮类化学成分得到指认,江南卷柏特征图谱与其分类关系最近的兖州卷柏、旱生卷柏的特征图谱有明显区别.罗布斯塔双黄酮、罗布斯塔双黄酮-4'-甲醚为首次从旱生卷柏中发现.结论:该方法简便,可靠,实用性强,能准确地鉴别江南卷柏以及近缘混淆品,为江南卷柏的鉴定提供了科学依据.

目的:建立五灵脂药材的超高效液相色谱法(UPLC)指纹图谱,结合化学模式识别法评价不同产地五灵脂药材质量.方法:采用UPLC建立指纹图谱,色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(梯度洗脱),检测波长为 265 nm,流速为 0.25 mL·min-1,柱温为 30℃,进样量为 1.0 μL.结合相似度评价、聚类热图分析及正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)综合评价不同产地五灵脂药材质量.结果:建立的五灵脂药材UPLC指纹图谱共标定 14 个共有峰,指认出其中 6 个成分,分别为原儿茶酸、4-羟基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮;22 批五灵脂药材相似度为 0.870～0.998;聚类热图分析将 22 批五灵脂药材分为两类,陕西省商洛市所产五灵脂可与其他产区样品完全区分;OPLS-DA共筛选出 7 个质量差异标志性成分.结论:建立的五灵脂药材UPLC指纹图谱及其化学模式识别方法稳定可行,可为五灵脂药材质量研究提供参考.

目的 建立高灵脂配方颗粒高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,并测定穗花杉双黄酮和山柰酚的含量,为高灵脂配方颗粒的质量控制提供参考.方法 采用COSMOSILC18色谱柱,以甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0mL·min-1,检测波长350 nm,建立15批高灵脂配方颗粒的HPLC指纹图谱,采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)"进行相似度评价,并对共有峰进行指认.结果 建立了高灵脂配方颗粒指纹图谱,标定了 10个共有峰,指认了 2个峰,15批高灵脂配方颗粒相似度均＞0.90.含量测定结果显示,穗花杉双黄酮和山柰酚分别在质量浓度为1.60～206.00 μg·mL-1和1.31～181.00μg·mL-1内与峰面积线性关系良好(r≥0.9999),精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0％,平均加样回收率分别为102.44％和100.46％.结论 建立的指纹图谱和含量测定方法简便、可行、准确、重复性好,可为高灵脂配方颗粒的质量评价提供参考.

目的 考察穗花杉双黄酮对CYP2C8代谢酶活性的影响.方法 构建体外人肝微粒体代谢体系,以紫杉醇为探针底物,考察穗花杉双黄酮对CYP2C8活性的影响.大鼠连续7 d尾静脉注射穗花杉双黄酮3 mg·kg-1,考察紫杉醇在大鼠体内的药动学.采用HPLC-MS/MS法分别测定体外代谢体系中6α-羟基紫杉醇及大鼠血浆中紫杉醇的含量.结果 穗花杉双黄酮在体外对CYP2C8有较强的抑制效应,半数抑制浓度(IC50)=0.2765 μmol·L-1,抑制常数(Ki)=0.034μmol·L-1,抑制类型为混合型抑制.给予3 mg·kg-1穗花杉双黄酮不会通过与CYP2C8的直接相互作用而改变紫杉醇的药动学.结论 穗花杉双黄酮为人肝微粒体中CYP2C8代谢酶的强抑制剂,但在体内对CYP2C8的活性无影响.

目的 研究穗花杉双黄酮(AF)调节Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对鼻咽癌(NPC)细胞恶性生物学行为的影响.方法 将NPC细胞株CNE-1随机分为对照组、低浓度AF组(AF-L组,50 μmol·L-1 AF)、中浓度 AF 组(AF-M 组,75 μmol·L-1 AF)、高浓度AF组(AF-H组,125 μmol·L-1 AF)和高浓度AF+Ras激活剂RASAL1组(AF-H+RASAL1 组,125 μmol·L-1 AF+2 ng·mL-1 RASAL1).以噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖能力;以划痕愈合实验检测细胞迁移能力;以Transwell实验检测细胞侵袭能力;以流式细胞术检测细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达.结果 对照组、AF-M组、AF-H 组 CNE-1 细胞 OD490值(48 h)为 0.62±0.06、0.45±0.05、0.29±0.03;细胞划痕愈合率为(38.66±4.07)％、(23.14±2.20)％、(12.47±1.15)％;细胞侵袭数目为(137.59±10.25)、(103.42±8.49)、(76.38±7.96)个;Ras 蛋白表达水平分别为0.84±0.08、0.59±0.06、0.34±0.03;Raf蛋白表达水平分别为0.79±0.08、0.53±0.05、0.24±0.02;MEK 蛋白表达水平分别为 0.87±0.09、0.64±0.06、0.28±0.03;ERK1/2 磷酸化水平分别为 0.75±0.08、0.50±0.05、0.21±0.02;细胞凋亡率分别为(4.25±0.63)％、(18.42±2.10)％、(35.28±2.26)％,以上指标,AF-M组、AF-H组与对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).RASAL1减弱了 AF对NPC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,抑制了其凋亡.结论 AF可能通过下调Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制NPC细胞增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡.

目的 探讨微波辅助萃取石上柏穗花杉双黄酮的工艺优化.方法 采用微波辅助萃取,以穗花杉双黄酮的提取率为指标,考察提取溶剂、固液比、微波功率、提取时间、提取温度对提取工艺的影响.结果 最佳工艺条件为采用95％乙醇提取溶剂,固液比为1:15 (g/mL),微波功率500 w,提取时间为40 min,提取温度为50℃.结论 该方法节省时间、节约能量、提取效率高、控制方便.