T细胞受体(TCR)序列可作为分辨T细胞特异性的唯一标签,因其多样性的特征,在特定时间内个体循环系统中所有TCR构成的TCR组库可以反映个体的抗肿瘤免疫状态.单细胞TCR测序技术能够在单细胞水平上检测编码TCR双链的基因序列和表达量等信息,包括获得TCR的α链和β链的配对信息,从而在细胞水平上更为准确地探索TCR组库的异质性,还可结合其他技术将TCR序列与基因组、转录组、蛋白质组等多组学信息成套配对,精准展现细胞水平上的多角度信息.因该技术具有高通量、高分辨率的优势而被广泛应用于肿瘤免疫治疗相关研究,为探索TME中T细胞功能、发展T细胞受体工程化T细胞(TCR-T)疗法、预测免疫检查点抑制剂(ICI)疗效等提供重要依据,成为重要的筛选工具,期待该技术的发展使更多肿瘤患者受益.

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:掌握克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）片段的精细抗原表位谱分布，明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热（CCHF）实验室检测中的价值。方法:2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽，以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7（IgM）或CCHFV阳性羊血清为抗体，用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位（BCE），并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类，确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性，探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒（pET-32a、pGEX-KG）和带有不完整谷胱甘肽（GST188）标签的原核表达质粒（pXXGST-ST-1）构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位，建立间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测方法，以经免疫荧光法（IFA）鉴定的CCHF羊血清为对照，统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果:CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE，其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP 2（aa 170~305）有6个BCE，两端的NP 1（aa 1~200）和NP 3（aa 286~482）有9个BCE；GP片段的Gc（aa 1~558）和Gn（aa 533~708）片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽（AP），NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%，GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中，由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4（Ap）6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲 5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP（全长）、PGEX-KG-NP 2（aa 170~305）、pGEX-KG-NP 2-1（aa 235~275）、PGEX-KG-NP 2-1-1（aa 237~256）、pXXGST-1-NP 2-1-2（aa 250~265）和PGEX-KG-NP 2-1-3（aa 260~276）6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清（pAb）免疫印迹反应阳性，以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照，以NP 2和NP 2-1 2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好，敏感度分别为73.4%（11/15）和66.7%（10/15），特异度分别为100%（18/18）和94.4%（17/18），总符合率分别为87.9%（29/33）和81.8%（27/33）。 结论:CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE，其中，优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

目的:用高通量方法筛选口腔鳞癌放疗抵抗相关的激酶基因，为口腔鳞癌的临床治疗决策提供理论基础。方法:以慢病毒构建的短发夹核糖核酸(shRNA)激酶文库(含4 675个不同shRNA序列，覆盖709个人激酶基因)感染舌鳞癌Cal-27细胞，嘌呤霉素筛选去除未成功感染的细胞后，以光子射线进行照射(0、10和15 cGy)，然后继续培养3 d，以增加不同射线抗性细胞的丰度差异。提取细胞基因组DNA，利用PCR获得完整shRNA序列，同时每组引入不同标签序列，利用illumina平台进行二代测序，找出丰度发生显著变化的shRNA，其对应基因即为影响射线抗性的基因。结果:本次实验共筛选到5个影响口腔鳞癌放射线抗性的激酶基因，其中，PKLR和IPMK敲减后会增加射线抵抗，AURKB、ITPKB和DLG2敲减后会导致放射敏感，其高表达会导致患者对放疗耐受。结论:本研究利用shRNA慢病毒文库结合二代测序方法筛选到3个口腔鳞癌放射抵抗基因，但具体作用机制尚需进一步探究。

目的:通过蛋白重组技术低成本、快速制备高浓度人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）参考物质，解决临床hRBP4高值参考物质难以获取的需求。方法:在美国国立生物技术信息中心NCB查找hRBP4的互补DNA序列，经大肠埃希菌密码子优化后人工合成，然后将DNA片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，以构建重组hRBP4表达载体。将重组质粒转化至 E. coli BL21感受肽中，优化诱导表达条件（如温度、转速和异丙基硫代半乳糖苷IPTG浓度等）、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化，获取纯化后的hRBP4重组蛋白。 结果:DNAMAN软件对比显示编码hRBP4蛋白的碱基序列完全正确，成功构建重组hRBP4原核表达质粒；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示亲和纯化产物中可清晰可见约相对分子质量26 000电泳条带；临床尿液和血清hRBP4常规检测系统均可检测到纯化的hRBP4蛋白，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系。结论:成功构建重组hRBP4高水平表达系统，重组hRBP4蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有望在室间质量评价质控品和有证参考物质研制中发挥重要作用。

目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:构建人降钙素原（hPCT）原核表达载体，低成本、快速、高浓度、高纯度获取hPCT纯化蛋白，为临床实验室检测制备质控品和参考物质奠定基础。方法:将GenBank提供的hPCT编码序列经大肠杆菌密码子优化后，人工合成DNA片段克隆至pET-28a(+)原核表达载体以构建重组hPCT表达质粒。转化至大肠杆菌 E. coli BL21感受态中，优化诱导表达条件、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化。 结果:成功构建重组hPCT原核表达质粒，优化异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达浓度及诱导温度，最适IPTG浓度为0.2 mmol/L，最佳诱导温度为37 ℃。纯化后hPCT蛋白可通过临床检测，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系，回归方程为y=-0.0085x+112.63， R2值为0.9975。 结论:成功构建重组hPCT的高效表达系统，重组hPCT蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有成为候选室间质量评价参考物质的潜力。

目的:观察过表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）刺突蛋白（S-蛋白）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞生长的抑制作用。方法:构建SARS-CoV-2 S-蛋白基因片段表达质粒（p3xflag-S），并转染至ARPE-19、HEK293细胞内，应用DNA测序进行鉴定，并对表达的标签蛋白进行蛋白免疫印迹法（Western blot）检测。HEK293细胞分为细胞1、2、3、4，分别转染GFP11质粒和空载质粒、GFP1-10质粒和空载质粒、GFP11质粒和pCMV-HA-ACE2质粒、GFP1-10和p3xflag-S质粒。将细胞1与细胞2（对照组1）、细胞2与细胞3（对照组2）、细胞3与细胞4（观察组）、细胞1与细胞2、3、4（对照组3）混合共培养。明场显微镜和荧光显微镜观察细胞融合情况。将RPE细胞分为对照组、过表达S-蛋白组。流式细胞仪检测RPE细胞周期；计数试剂盒8（CCK-8）检测RPE细胞增生水平；Western blot检测RPE细胞中S-蛋白表达水平。组间比较行最小显著差法 t检验。 结果:DNA序列测定结果显示，S-蛋白cDNA与标签蛋白融合；Western blot检测结果显示，与未转染p3xflag-S质粒的细胞比较，转染HEK293细胞中S-蛋白相关表达量升高。明场显微镜下可见大而多核的融合细胞团；荧光显微镜下可见融合细胞内有多个细胞核且呈明显绿色荧光。Western blot检测结果显示，与未转染p3xflag-S质粒的RPE细胞比较，转染p3xflag-S质粒的RPE细胞中S-蛋白相关表达量升高。CCK-8增生分析结果显示，与对照组比较，过表达S-蛋白组RPE细胞增生能力显著降低，差异有统计学意义（ t=22.70、16.75、23.38， P<0.000 1）。流式细胞仪检测结果显示，对照组、过表达S-蛋白组G1期细胞分别为41.1%、67.0%；与对照组比较，过表达S-蛋白组G1期细胞明显升高，差异有统计学意义（ t=4.76， P＝0.018）。过表达S-蛋白组细胞凋亡率较对照组明显增加，差异有统计学意义（ t=4.91， P=0.008）。 结论:过表达SARS-CoV-2 S-蛋白可抑制RPE细胞生长活性。

目的:探讨多模态MRI影像组学模型术前预测乳腺癌人表皮生长因子受体2（HER-2）表达状态的价值。方法:纳入2021年1月至2023年5月镇江市第一人民医院经术后病理诊断的女性乳腺癌患者187例，其中HER-2阴性139例，HER-2阳性48例。将患者分为训练集（131例）和验证集（56例），利用训练集构建预测模型，利用验证组对预测模型进行验证。在T2加权成像（T2WI）、表观扩散系数（ADC）及动态增强扫描第2期（DCE-2）、第6期（DCE-6）MRI图像中逐层勾画乳腺癌原发灶三维立体感兴趣区，使用Pyradiomic软件提取960个影像组学特征，通过重复性分析、Pearson相关分析及最小绝对收缩和选择算子回归方法进行筛选和降维后，建立影像组学标签，采用logistic回归分析分别构建预测乳腺癌HER-2表达状态的T2WI影像组学模型、ADC影像组学模型、DCE-2影像组学模型、DCE-6影像组学模型和联合序列影像组学模型。基于患者的临床、病理及MRI影像特征，采用单因素和多因素logistic回归分析构建临床病理MRI特征模型。利用患者的影像组学标签联合筛选得到的有统计学意义的临床病理MRI特征，构建列线图模型。采用受试者工作特性（ROC）曲线评价各模型的预测效能，绘制决策曲线评价列线图模型的临床获益。结果:成功构建了预测乳腺癌HER-2表达状态的T2WI影像组学模型、ADC影像组学模型、DCE-2影像组学模型、DCE-6影像组学模型、联合序列影像组学模型、临床病理MRI特征模型和列线图模型。ROC曲线分析显示，在训练集和验证集中，T2WI影像组学模型的曲线下面积（AUC）分别为0.797和0.760，ADC影像组学模型的AUC分别为0.776和0.634，DCE-2影像组学模型的AUC分别为0.804和0.759，DCE-6影像组学模型的AUC分别为0.869和0.798，联合序列影像组学模型的AUC分别为0.908和0.847，临床病理MRI特征模型的AUC分别为0.703和0.693，列线图模型的AUC分别为0.938和0.859。在训练集中，联合序列影像组学模型的AUC高于T2WI、ADC、DCE-2影像组学模型和临床病理MRI特征模型（均 P＜0.05）；在验证集中，联合序列影像组学模型的AUC高于ADC影像组学模型（ P＜0.01），但与临床病理MRI特征模型差异无统计学意义（ P＞0.05）。在训练集中列线图模型的AUC高于全部单模态影像组学模型和临床病理MRI特征模型（均 P＜0.05），在验证集中列线图模型的AUC高于ADC影像组学模型、DCE-2影像组学模型和临床病理MRI特征模型（均 P＜0.05）。在训练集和验证集中列线图模型的AUC与联合序列影像组学模型差异均无统计学意义（均 P＞0.05）。决策曲线显示，列线图模型术前预测乳腺癌HER-2表达状态的临床净获益明显优于临床病理预测模型。 结论:基于T2WI、ADC和早期-延迟期DCE MRI的多模态MRI影像组学模型能高效预测术前乳腺癌HER-2表达状态，有望用于乳腺癌HER-2状态的术前无创评估，为乳腺癌术前新辅助治疗方案的决策提供依据。

目的 对艾草Artemisia argyi β-石竹烯合成酶基因(β-caryophyllene synthase,AaCPS)进行全长克隆、亚细胞定位与表达模式分析,为艾草倍半萜生物合成途径中的基因功能解析奠定基础.方法 基于艾草转录组数据筛选注释为CPS的基因,采用PCR方法克隆获得目的基因cDNA的全长,对其编码区进行生物信息分析;构建原核表达载体,转化至大肠杆菌中进行诱导表达;构建绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,利用农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法进行亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析不同采收期(4月、5月、6月、7月)AaCPS基因表达模式,HS-SPME-GC-MS测定β-石竹烯含量并进行相关性分析.结果 从艾草中克隆得到的AaCPS基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为1647 bp,编码548个氨基酸,相对分子质量为63 667 Da,等电点为5.40,含Terpene_synth和Terpene_synth_C保守结构域.系统进化分析显示AaCPS蛋白与同科植物黄花蒿CPS蛋白的亲缘关系最近.SDS-PAGE结果证实在75 000-120 000 Da出现目的蛋白条带(包含28 132 Da的标签蛋白),说明所获基因能够成功表达出蛋白;亚细胞定位显示其编码蛋白位于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明AaCPS基因表达量呈上升趋势,在7月达到最高.HS-SPME-GC-MS结果显示β-石竹烯含量从4月逐渐升高,在6月达到最高,与4-6月AaCPS基因表达量趋势总体一致.结论 通过对AaCPS基因的克隆与分析,为进一步研究该基因在艾草倍半萜物质生物合成途径的功能鉴定奠定基础.