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下调热休克蛋白B8在视神经损伤中对小鼠视网膜神经节细胞的保护作用
编辑人员丨5天前
目的:观察敲低热休克蛋白B8 (HspB8)对鼠视神经钳夹(ONC)后视网膜神经节细胞(RGC)及视网膜功能的影响。方法:构建敲低HspB8的重组腺相关病毒(AAV) 2-小发夹HspB8 (shHspB8)-绿色荧光蛋白(GFP)。雄性C57BL/6J小鼠66只随机分为正常对照组、ONC组、AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2组,分别为10、20、16、10、10只,双眼均作为实验眼。建模后3、7 d,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测小鼠视网膜HspB8蛋白相对表达变化;GFP免疫荧光染色确定AAV2-shHspB8-GFP转染情况。建模后5 d,视动反应(OMR)、暗适应全视野闪光视网膜电图(ff-ERG)检测各组小鼠视敏度、振荡电位(OPs )、明视负向反应(PhNR)振幅和潜伏期;视网膜铺片计数各组小鼠RGC。采用Mann-Whitney U检验、独立样本 t检验、Welch法校正 t检验、单因素方差分析、Bonferroni t检验对数据进行统计分析。 结果:与正常对照组比较,ONC3组小鼠视网膜中HspB8蛋白相对表达量明显增加,差异有统计学意义( F=43.63, P<0.01 )。与正常对照组比较,ONC5组小鼠视敏度明显降低,差异有统计学意义( P<0.01);a波、b波、OPs、PhNR振幅下降,b波潜伏期延长,差异均有统计学意义( P<0.05);ONC3组、ONC5组、ONC7组小鼠RGC存活率呈时间依赖性降低,差异有统计学意义( F=384.90, P<0.01 )。病毒转染后4周,转染率达峰值。与正常对照组相比,AAV2-shHspB8组视敏度,a波和b波、OPs、PhNR振幅、RGC计数差异均无统计学意义( P>0.05);ONC5+AAV2-shHspB8组RGC计数较ONC5组明显升高,差异有统计学意义( F=10.62, P<0.01 )。 结论:ONC诱导HspB8在视网膜中表达,导致RGC死亡并损害小鼠视功能;下调HspB8对ONC所致的RGC死亡具有保护作用。
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编辑人员丨5天前
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过表达Krüppel样因子7对小鼠视神经钳夹后视网膜神经节细胞保护作用及机制研究
编辑人员丨5天前
目的:观察过表达Krüppel样因子7 (KLF7)对视神经钳夹损伤(ONC)后小鼠视网膜神经节细胞(RGC)的保护作用和机制。方法:10周龄C57BL/6J小鼠65只随机分为空白对照组(A组)、玻璃体腔注射(IVT)-KLF7组(B组)、IVT-磷酸盐缓冲液-ONC组(C组)、IVT-KLF7-ONC组(D组)、IVT-重组腺相关病毒2-重组绿色荧光蛋白-ONC组(E组),每组各13只小鼠。建立ONC模型后7 d,处死各组小鼠。全视网膜铺片免疫荧光染色计数RGC存活率;蛋白质免疫印迹法检测小鼠视网膜组织中KLF7、神经生长因子(NGF)、酪氨酸激酶A (TrkA )、磷酸化TrkA (pTrkA )、酪氨酸激酶B (TrkB )、磷酸化TrkB (pTrkB )、生长相关蛋白43 (GAP43 )、脑源性神经营养因子、B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶3 (Caspase-3)蛋白相对表达水平。组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验。结果:ONC后7 d,A组、B组、C组、D组、E组视网膜中RGC密度分别为(3 707.4±12.8)、(3 582.4±13.3)、(1 396.3±16.1)、(1 658.3±22.2)、(1 323.6±16.9)个/mm 2;与C组、E组比较,D组RGC密度显著升高,差异有统计学意义( P=0.028、0.007)。与A组、B组、C组、E组比较,D组小鼠视网膜中NGF、pTrkA、pTrkB、GAP43、Bcl-2蛋白相对表达量升高,BAX、Caspase-3蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义( P<0.01 )。 结论:小鼠ONC模型中,过表达KLF7可相对提高RGC存活率,提高视网膜中NGF、pTrkA、pTrkB、GAP43、Bcl-2蛋白相对表达量,降低BAX、Caspase-3蛋白相对表达量。
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编辑人员丨5天前
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小鼠视神经损伤对视网膜神经节细胞存活率的影响
编辑人员丨5天前
目的:探讨小鼠视神经钳夹损伤(ONC)后视网膜神经节细胞(RGCs)存活率变化。方法:选取97只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,按照随机数字表法分为正常组(5只)、假手术组(5只)、ONC组(87只)。正常组双眼不进行任何操作;假手术组左眼不进行任何操作,右眼行假手术操作;ONC组左眼行ONC,右眼行假手术对照。正常组分别计算左右眼RGCs密度,比较其差异;假手术组计算假手术眼RGCs密度,比较其与正常组平均RGCs密度的差异;ONC组中,以左眼(ONC眼)与右眼(假手术眼)RGCs密度的比值计算RGCs存活率,然后比较不同钳夹持续时间(5,10,20,30 s)的RGCs存活率差异(取材时间统一为钳夹后7 d),以及不同取材时间(3,4,5,7,14,30,60,90,180 d)的RGCs存活率差异(钳夹持续时间统一为20 s)。结果:正常组左右眼RGCs密度分别为(5 167.3±55.6)个/mm 2和(5 199.6±44.8)个/mm 2,差异无统计学意义( P>0.05)。正常组与假手术组RGCs密度分别为(5 183.5±33.4)个/mm 2和(5 151.5±87.6)个/mm 2,差异无统计学意义( P>0.05)。ONC组不同钳夹时间(5,10,20,30 s)的RGCs存活率分别为(37.6±1.1)%、(34.0±0.9)%、(33.6±1.6)%、(30.3±0.6)%( P<0.01)。钳夹5 s与 30 s相比,ONC组小鼠RGCs存活率差异有统计学意义( P<0.01);其余不同钳夹时间相比,ONC组小鼠RGCs存活率差异均无统计学意义( P>0.05)。ONC组不同取材时间(3,4,5,7,14,30,60,90,180 d)的RGCs存活率分别为(85.4±2.0)%、(67.6±3.1)%、(43.0±1.0)%、(33.6±1.6)%、(22.7±2.0)%、(12.8±0.6)%、(10.4±0.8)%、(8.6±0.5)%、(6.7±0.2)%( P<0.01),尤其3~5 d,RGCs存活率大幅下降,30 d后RGCs存活率呈平稳下降趋势。 结论:在ONC小鼠模型中,不同钳夹持续时间对RGCs造成的损伤程度不同,且ONC后RGCs死亡呈进行性发展,提示在原发性损伤(钳夹)后,小鼠的RGCs经历了继发性损伤。因此,有效控制RGCs的继发性损伤,可能成为治疗视神经损伤性疾病的关键。
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编辑人员丨5天前
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DJ-1蛋白对视神经钳夹伤后小鼠视网膜神经节细胞及视功能的影响
编辑人员丨5天前
目的:观察Park7基因编码的DJ-1蛋白对小鼠视神经钳夹损伤(ONC)后视网膜神经节细胞(RGC)及视功能的影响。方法:健康雄性C57BL/6J小鼠37只和116只分别随机分为正常组、ONC 2 d组、ONC 5 d组、ONC 7 d组和对照组、Park7组、Park7-ONC组、ONC组、绿色荧光蛋白(GFP)-ONC组。ONC 2 d组、ONC 5 d组、ONC 7 d组小鼠分别于建立ONC模型后2、5、7 d处死取材,进行后续实验。Park7组、Park7-ONC组小鼠玻璃体腔注射敲低Park7基因的重组腺相关病毒(rAAV)1 μl,GFP-ONC组小鼠玻璃体腔注射仅带有GFP的rAAV 1 μl;注射后4周观察病毒转染情况。ONC组、Park7-ONC组、GFP-ONC组玻璃体腔注射后23 d,建立ONC模型,建模后5 d取材进行后续实验。视网膜铺片免疫荧光染色观察RGC平均密度变化;全视野闪光视网膜电图检测各组小鼠a波、b波和明视负向反应(phNR)潜伏期及振幅变化和振荡电位(OPs)振幅变化;视动反应(OMR)检测小鼠视敏度;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠视网膜中DJ-1、Bax、B淋巴细胞瘤/白血病-2 (Bcl-2)蛋白相对表达水平。多组间数据比较采用单因素方差分析;组间两两比较采用最小显著差法 t检验。 结果:与正常组比较,ONC 2 d组、ONC 5 d组小鼠视网膜DJ-1蛋白相对表达量均显著上升,差异有统计学意义( t=16.610、5.628, P<0.01、<0.05)。病毒转染后4周,Park7组小鼠视网膜RGC层、内丛状层可见强GFP表达。与对照组比较,ONC组小鼠视网膜RGC密度明显下降,差异有统计学意义( t=16.520, P<0.000 );与ONC组比较,Park7-ONC组小鼠视网膜RGC密度明显下降,差异有统计学意义( t=6.074, P<0.01 )。随刺激光亮度增加,对照组小鼠暗适应a波、b波潜伏期逐渐缩短,振幅逐渐增大。刺激光亮度3 cd·s/m 2,对照组、Park7组、Park7-ONC组、ONC组、GFP-ONC组小鼠暗适应a波、b波潜伏期及振幅比较,差异均无统计学意义(潜伏期: F= 0.503、2.592, P=0.734、0.068;振幅: F= 0.439、1.451, P=0.779、0.247 );与对照组比较,ONC组小鼠Ops、PhNR振幅明显下降,差异有统计学意义( t=15.07、12.80, P<0.000、<0.001);与ONC组比较,Park7-ONC组小鼠Ops、PhNR振幅明显下降,差异有统计学意义( t=4.042、5.062, P<0.05、<0.01);各组小鼠PhNR潜伏期比较,差异无统计学意义( F=1.327, P=0.287 )。与对照组比较,ONC组小鼠视敏度明显下降,差异有统计学意义( t=23.020, P<0.000 );与ONC组比较,Park7-ONC组小鼠视敏度明显下降,差异有统计学意义( t=3.669, P<0.05 )。Park7组与对照组、Park7-ONC组与ONC组比较,小鼠视网膜中DJ-1蛋白相对表达量均明显下调,差异有统计学意义( t=47.140、26.920, P<0.000、<0.000);ONC组与GFP-ONC组比较,差异无统计学意义( t= 0.739, P=0.983 )。与ONC组比较,Park7-ONC组小鼠视网膜中Bax蛋白相对表达量明显升高,Bcl-2蛋白相对表达量明显降低,差异均有统计学意义( t=5.960、9.710, P<0.05、<0.05);Park7-ONC组Bcl-2/Bax相对表达量比值明显低于ONC组,差异有统计学意义( t=13.620, P<0.01 )。 结论:敲低Park7基因后其编码的蛋白质DJ-1表达下调,加重ONC模型小鼠RGC损伤以及视网膜电生理反应及视功能下降。
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编辑人员丨5天前
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低频超声联合微泡介导曲安奈德靶向释放在大鼠外伤性视神经病变中的应用研究
编辑人员丨1个月前
目的 探讨低频超声联合微泡(LUSMB)介导曲安奈德(TA)靶向释放在大鼠外伤性视神经病变中对视网膜神经节细胞(RGCs)的保护和再生作用.方法 选取20只SD大鼠,建立视神经钳夹损伤模型,随机均分为4组,分别标记为单纯损伤组(Control组)、药物组(TA组)、超声微泡组(MU组)、超声联合TA微泡组(TAMU组),大鼠以右眼为实验眼,左眼为空白对照组(NC组).药物及微泡混悬后通过 Tenon's囊注射,术后第1天对MU组及TAMU组实施低频超声处理.术后第14天,利用视网膜免疫荧光铺片染色计数并统计存活率,苏木精-伊红染色观察视神经病理改变,CTB标记评估视神经轴突再生情况.结果 视网膜免疫荧光铺片显示与Control组对比,所有治疗组RGCs存活率更高(P<0.01);其中TAMU组的存活率较TA组、MU组更高(P<0.05).HE染色病理提示TAMU组能相对减轻病理改变,减少炎症细胞向损伤部位的浸润.但CTB顺行标记显示治疗组与Control组之间再生轴突数量无明显统计学意义(P>0.05).结论 LUSMB能促进TA在眼后段组织的靶向释放,减轻视神经损伤的炎症反应,延缓RGCs凋亡.
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编辑人员丨1个月前
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Thy1-YFP转基因小鼠视网膜神经节细胞的存活率
编辑人员丨2024/3/16
目的:研究转基因小鼠Thy1-YFP在视神经钳夹(ONC)模型和谷氨酸兴奋性毒性(NMDA)模型中YFP阳性视网膜神经节细胞(YFP+RGCs)的存活率与总体RGCs(RBPMS+RGCs)的存活率差异,以期为Thy1-YFP小鼠在视神经退行性病变中的进一步研究提供实验数据支持.方法:8周龄Thy1-YFP小鼠(雌雄不限)共20只,采用随机数字表法将小鼠随机分为正常组、ONC模型组和NMDA模型组.正常组小鼠进行左右眼对照;模型组小鼠均采用单眼造模,对侧眼为对照眼.其中,ONC小鼠于钳夹后7 d取材,NMDA小鼠于NMDA玻璃体腔注射后24 h取材.取材后,通过全视网膜铺片荧光染色和激光共聚焦拍照的方式获取RGCs信息,利用Image J计数YFP+RGCs和总体RBPMS+RGCs.统计分析ONC模型和NMDA模型中YFP+RGCs的存活率与总体RBPMS+RGCs的存活率差异,存活率差异以实验眼与对照眼的YFP+RGCs(或RBPMS+RGCs)的密度比值计算.结果:Thy1-YFP转基因小鼠视网膜上YFP+RGCs和RBPMS+RGCs的平均密度左右眼一致,具有可比性,其中YFP+RGCs约占总RGCs的0.19%.在ONC模型中,与对照眼相比,ONC眼的YFP+RGCs与RBPMS+RGCs的密度都出现了大幅度下降.YFP+RGCs的平均存活率为(59.4±8.2)%,而RBPMS+RGCs为(33.0±1.7)%,差异达26.4%(P<0.001).在NMDA模型中,与对照眼相比,NMDA注射眼的YFP+RGCs与RBPMS+RGCs的密度亦都出现了大幅度下降.YFP+RGCs的存活率为(46.1±6.0)%,而RBPMS+RGCs为(32.4±3.5)%,差异达13.7%(P<0.01).结论:转基因小鼠ONC模型与NMDA模型表明YFP+RGCs存活率并不能良好地反映总RGCs的存活率,说明Thy1-YFP小鼠的RGCs并不能代表总体RGCs,存在一定的RGCs亚类特异性.本研究结果为Thy1-YFP小鼠在视神经退行性病变中的研究提供了数据支持,进一步加深了研究者对于Thy1-YFP转基因小鼠的认识,为将来的研究提供了方向和借鉴.
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编辑人员丨2024/3/16
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视神经夹持损伤模型大鼠视网膜和视神经小胶质细胞的活化
编辑人员丨2023/8/6
背景 外伤性视神经病变(TON)是继发于外力创伤下的急性视神经损伤,预后较差.小胶质细胞作为中枢神经系统中重要的免疫细胞,参与了中枢神经系统疾病与多种眼科疾病的病理生理过程.然而,小胶质细胞在TON的病理发展及损伤修复过程中的作用尚不明确. 目的 比较大鼠视神经夹持损伤后视神经与视网膜中小胶质细胞的形态变化、激活数量、分布情况及活化水平的差异. 方法 将35只SPF级健康雌性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠按照随机数字表法分为正常对照组,造模后6h、3d、7d、14 d、30 d组和假手术组,每组5只大鼠.造模后各时间点组用夹持钳以50 g的夹持力在大鼠眼球后约2 mm处钳夹视神经10s,建立大鼠视神经夹持模型,假手术组大鼠行相同的手术操作但不夹持视神经,正常对照组不做任何处理.分别于上述时间点制备大鼠视神经和视网膜冰冻切片,采用lectin-FITC荧光标记抗体检测各组大鼠视神经和视网膜中的小胶质细胞数量和激活的小胶质细胞数量. 结果 正常对照组和假手术组大鼠视网膜中小胶质细胞主要位于内丛状层(IPL),少部分位于内核层(INL)和神经节细胞层(GCL),外核层(ONL)和外丛状层(OPL)未见小胶质细胞分布.正常对照组大鼠视网膜小胶质细胞的细胞体较小,以分支状为主,突触细长,可见二级分支.各模型组大鼠视网膜中小胶质细胞主要位于GCL和IPL,小胶质细胞在GCL的数量明显多于假手术组,小胶质细胞多为阿米巴状,部分呈半激活态,少见分支静息态.正常对照组、假手术组及造模后6h、3d、7d、14 d和30 d组大鼠视网膜中小胶质细胞数分别为6.40-±-1.52、7.20±2.05、12.00±3.54、14.00±4.06、18.00±4.36、18.40±3.13和10.80±1.92,造模后各时间点大鼠视网膜中小胶质细胞数量均明显多于正常对照组,造模后30 d小胶质细胞数量明显少于造模后7d和14d组,差异均有统计学意义(均P<0.05);造模后3、7和14d组大鼠视网膜中激活小胶质细胞数量明显多于假手术组,差异均有统计学意义(P=0.024、0.009、0.023).正常对照组和假手术组大鼠视神经中小胶质细胞较小,呈棒状或分枝状,分布均匀且稀疏.造模后各时间点组小胶质细胞较假手术组细胞体积增大,呈阿米巴状并分布在近视神经夹持部位.造模后6h、3d、7d、14d大鼠视神经中小胶质细胞数量明显多于正常对照组,差异均有统计学意义(P=0.007、0.001、0.003、0.014).造模后30 d大鼠视神经中小胶质细胞数量明显少于造模后3d、7d和14 d组,差异均有统计学意义(均P<0.05).造模后6h、3d和7d组大鼠视神经中活化小胶质细胞数量明显多于假手术组,差异有统计学意义(P=0.005、0.004、0.030),造模后14d、30 d大鼠视神经中活化的小胶质细胞数量较造模后3d组明显减少,差异均有统计学意义(P=0.021、0.004),造模后6h组视神经中激活态小胶质细胞增加并持续到造模后14d.结论 大鼠视神经夹持损伤后一定时间内视网膜及视神经中小胶质细胞增加并活化,视神经中小胶质细胞的活化及其衰减均早于视网膜,视神经中小胶质细胞活化程度更明显.
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编辑人员丨2023/8/6
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法舒地尔对大鼠视神经损伤的修复作用
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨法舒地尔(Fasudil)对大鼠视神经损伤的修复作用.方法 将60只SD大鼠随机分成3组:正常组12只、对照组(生理盐水组)、治疗组(法舒地尔干预组)各24只.正常组大鼠无任何干预.两实验组大鼠建立球后视神经钳夹伤模型.造模成功1h后,治疗组注射法舒地尔10 mg/kg,对照组注射等量生理盐水,于损伤后3、7、14及21 d取材、做切片行HE染色观察视网膜组织及RGCs的变化,行免疫组化检测视网膜平均光密度值(AOD).结果 HE染色示各时间点正常组的RGCs数量较实验组高(P=0.00,0.00,0.00,0.00);治疗组视网膜组织损伤情况较同一时间点的对照组损伤程度轻;治疗组各时间点的细胞数量较对照组高(P=0.03,0.00,0.00,0.01).免疫组化示治疗组的脑源性神经营养因子(BDNF)表达量明显高于对照组(P=0.03,0.02,0.04,0.04).结论 法舒地尔能促进大鼠视神经损伤的修复再生,增强BDNF在受损视网膜组织中的表达.
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编辑人员丨2023/8/6
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以脑源性神经营养因子等干预视神经损伤大鼠视神经拉伸力学的特性分析
编辑人员丨2023/8/6
以拉伸力学性能指标研判以人脐血干细胞、脑源性神经营养因子干预视神经损伤动物模型的效果.以钳夹法制备视神经损伤大鼠模型,于视神经损伤大鼠模型造模7d后,分别以人脐血干细胞、脑源性神经营养因子进行干预治疗,对各组大鼠于造模30 d后取出眶内段视神经进行组织形态观察和拉伸实验.视神经组织形态观察结果表明,视神经损伤动物模型以BDNF干预组一部分神经纤维排列较整齐,胶质细胞可见少量细胞空泡,一部分细胞核排列不规则,但视神经轴突直径改变不明显.视神经损伤动物模型以hUCBSC干预组视神经纤维排列较密集,胶质细胞核增多,多数轴突形态正常.各组动物视神经拉伸实验结果表明,视神经损伤动物模型组视神经的最大载荷、最大应力、最大应变、弹性限度载荷、弹性限度应力小于视神经损伤模型以hUCBSC、以BDNF干预组,差异显著(P<0.05),视神经损伤模型以BDNF干预组的最大载荷、最大应力、最大应变、弹性限度载荷、弹性限度应力小于以hUCBSC干预组,差异显著(P<0.05).视神经损伤动物模型以BDNF和以hUCBSC干预后动物视神经的拉伸力学性能指标得到了显著提高.提示,视神经损伤模型大鼠通过BDNF、hUCBSC干预治疗后,具有明显的疗效.
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编辑人员丨2023/8/6
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视神经损伤后JNK3、APP蛋白的表达变化对视网膜神经节细胞存活的影响
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨视神经损伤后小鼠视网膜神经节细胞(RGCs)中JNK3、APP蛋白的表达变化及其对RGCs存活的影响.方法 取成年APP野生型小鼠,采用钳夹法建立视神经损伤模型,应用免疫组织化学、Western blot法检测造模后视网膜神经节细胞中JNK3、APP蛋白的定位和定量表达变化,比较损伤7 d后APP基因敲除组及其同窝野生型小鼠RGCs的存活数变化.结果 视神经损伤后,视网膜神经节细胞中JNK3定位于细胞浆,p-JNK则从细胞浆进入到细胞核中表达,APP定位于细胞膜、p-APP在轴突及细胞浆中均表达.同时, Western结果表明上述4种蛋白表达量在损伤1 d组比假手术组均升高(P<0.01).与APP野生型小鼠视网膜神经节细胞存活数(127.7±7.0)相比,APP基因敲除组小鼠视网膜神经节细胞存活数(147±7.0)明显增多(P<0.05).结论 视神经损伤后,JNK3、APP蛋白的表达增多在视网膜神经节细胞的存活中发挥了一定的作用.
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编辑人员丨2023/8/6
