目的:比较悬浮细胞MDCK和贴壁细胞MDCK两种培养体系对流感病毒分离培养的差异，探讨悬浮细胞的应用前景。方法:通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率，使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验，连续传代5次后观察血凝效价并对HA和NA基因进行测序，观察基因突变情况。结果:悬浮细胞的24 h、48 h活细胞密度较贴壁细胞更稳定；病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1∶256以上，而贴壁细胞则无滴度；悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变，贴壁细胞两个代次内未发现基因突变，NA基因均未发现基因突变。结论:悬浮MDCK细胞较贴壁细胞生长更为稳定，且病毒分离培养效率高，连续传代病毒突变率低，在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。

目的:构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)和核因子 κB1(nuclear factor kappa B1, NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK)，对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus, Flu)的增殖特性进行初步鉴定。 方法:采用CRISPR/Cas9技术，将MDCK细胞的 MAVS和 NFκB1基因敲除，获得稳定的敲除细胞系。接种Flu并检测培养上清中病毒的血凝(hemagglutinination, HA)滴度和TCID 50滴度，与野生MDCK细胞进行比较。 结果:获得2株稳定敲除的MDCK细胞系MDCK- MAVS－和MDCK- NFκB1 －，与野生MDCK细胞同样为贴壁的上皮样细胞。接种Flu后，2株敲除细胞系测定的病毒HA滴度与野生细胞相比无明显差异，TCID 50分别比野生MDCK细胞系提高了9.5倍和10倍，其差异有统计学意义( P＝0.0316)。 结论:本研究构建的2株基因敲除细胞系MDCK- MAVS－和MDCK- NFκB1 －能够提高Flu的感染力，为Flu的分离培养提供了新的候选细胞系。

目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养,建立悬浮细胞系,并进行检定,以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础.方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞,命名为MDCK-S细胞,进行18S及物种特异性PCR鉴定.将MDCK-S细胞传代至33代,作为主代细胞库(master cell bank,MCB);传代至38代,作为工作细胞库(working cell bank,WCB).MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测.结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞,且未发现突变、缺失等情况,无其他种属DNA污染.MCB及WCB细胞生长状态良好,生长曲线呈"S"型,倍增时间分别为27.78及27.21h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;细胞形态、结构及细胞膜完整,膜上微绒毛较多,表明细胞状态好,不同细胞代次之间差异较小;具有成瘤性,但不具有致瘤性;染色体2 n=(78±2)条占比为86％～96.19％,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定;对流感病毒较敏感.结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养,并建立了悬浮细胞系MDCK-S.本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础.

目的 确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件.方法 将3株甲型流感病毒(H1N1 NYMC X-181、H1N1 NYMC X-275和H3N2 NYMC X-263B)在贴壁MDCK细胞上进行传代培养,以其血凝效价和半数细胞感染剂量(median cell culture infective dose,CCID50)为检测指标,分别对其增殖条件胰酶浓度(0.5、1.25、2.5、3.5和4.5 μg/mL)、MOI(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1)、培养温度(33、34、35、36、37℃)、吸附时间(0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)、培养时间(24、48、72、96、120 h)进行优化.结果 H1N1 NYMC X-181、H1N1 NYMC X-275和H3N2 NYMCX-263B 3株流感病毒在贴壁MDCK细胞上增殖的最适胰酶浓度分别为2.5、1.25、1.25 μg/mL;最适MOI值均为0.01;最适培养温度均为34℃;最适吸附时间分别为1.5～2.0、1.5、1.5h;最适培养时间均为72 h.结论 确定了3株甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上的增殖条件,为后续相关疫苗的研发工作奠定了基础.

Tpl2是调节Ⅰ型(IFNα/β)和Ⅱ型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要.为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞(MOI =0.1),测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度.结果:靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2-/-);其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2-/-细胞培养上清的血凝效价提高了1.78 ～2.5倍.病毒接种后72h,MDCK-Tpl2-/-细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2.8倍.结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础.

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性.方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID50滴度,分析其病毒敏感性.结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×106 cells/mL以上,且差异无统计学意义(P＞0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P＞0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×106 cells/mL接种于5L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×106 cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h-1、(0.028±0.013)h-1、(0.027±0.013)h-1 (p＞0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6～7)log2 HA/25μL、CCID50为(4.35～4.68) lgCCID50/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9～10)log2 HA/25 μL,CCID50为(6.38～7.31) lgCCID50/mL.接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7～9)log2 HA/25μL、CCID50为(6.21～6.96)lgCCID50/mL.结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考.

目的 比较微载体与片状载体培养MDCK-G1细胞的效果.方法 在7.5L生物反应器中,分别使用微载体和片状载体培养MDCK-G1细胞,比较细胞的贴壁效率,并对搅拌转速、初始细胞接种密度、载体量进行优化.结果 微载体最适培养条件为搅拌转速55 r/min,初始细胞接种密度3×105个/mL,载体量8g/L,在此条件下最高细胞密度为(5.03±0.12)×106个/mL;片状载体最适培养条件为搅拌转速120 r/min,初始细胞接种密度2×105个/mL,载体量200g,在此条件下最高细胞密度为(10.22±0.69)×106个/mL.结论 片状载体能够用于MDCK-G1细胞的培养,且相对于微载体可获得更高的细胞密度,但有不易放大的缺点,作为细胞培养系统进一步开发具有很大的应用潜力.

目的 优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件.方法 以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)、胰酶终浓度(2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL)、细胞接毒密度(50× 104、100×104、300×104、500×104、700× 104个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化.同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较.结果 乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10-2、胰酶终浓度为10 μg/mL、细胞接毒密度为300×104个/mL、病毒收获时间为72 h.流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度(CCID50)均明显高于贴壁培养的MDCK细胞(P＜0.05).结论 优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件,为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础.

为建立贴壁培养型细胞最适血清的快速筛选方法,在含10％不同类型牛血清的DMEM培养液中连续传代培养MDCK细胞,分别用传代稳定性观察、绘制生长曲线、分析生长动力学与贴壁率的方法评价不同类型牛血清对MDCK贴壁细胞促生长效果的影响,并进一步在细胞工厂中扩大培养验证.结果显示,3种类型血清均能较好促进细胞的生长增殖且细胞生长曲线均呈"S"型;MDCK细胞生长动力学分析发现3种类型血清平均比生长速率差异不显著(P>0.05);最大增殖密度和倍增时间胎牛血清均优于新生牛血清;平均集落形成率分析发现,进口胎牛血清略高于国产胎牛血清(P=0.02)、国产新生牛血清低于国产和进口胎牛血清差异极显著(P<0.0001).国产新生牛血清在1层和10层细胞工厂中连续传代培养MDCK细胞,细胞生长良好,传代过程中细胞生长稳定.通过研究不同类型的牛血清对MDCK细胞培养效果的影响,为疫苗生产中MDCK细胞扩大培养和短时间内成功筛选出培养MDCK细胞的最佳血清提供一定的科学依据.

贴壁MDCK细胞因其诸多优点而被广泛用于分离流感病毒,但此方法影响因素较多,容易导致实验失败.近年来有大量关于此方法影响因素的研究,对提高流感病毒的分离效率有重要作用.本文对此进行分析和总结.