目的:比较悬浮细胞MDCK和贴壁细胞MDCK两种培养体系对流感病毒分离培养的差异，探讨悬浮细胞的应用前景。方法:通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率，使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验，连续传代5次后观察血凝效价并对HA和NA基因进行测序，观察基因突变情况。结果:悬浮细胞的24 h、48 h活细胞密度较贴壁细胞更稳定；病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1∶256以上，而贴壁细胞则无滴度；悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变，贴壁细胞两个代次内未发现基因突变，NA基因均未发现基因突变。结论:悬浮MDCK细胞较贴壁细胞生长更为稳定，且病毒分离培养效率高，连续传代病毒突变率低，在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。

目的 将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养,建立悬浮细胞系,并进行检定,以期为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础.方法 采用摇床适应法将贴壁培养的MDCK(NBL-2)细胞驯化为悬浮培养细胞,命名为MDCK-S细胞,进行18S及物种特异性PCR鉴定.将MDCK-S细胞传代至33代,作为主代细胞库(master cell bank,MCB);传代至38代,作为工作细胞库(working cell bank,WCB).MCB及WCB细胞均进行生物学特征、污染情况、透射电镜、成瘤性和致瘤性、染色体变异性及流感病毒敏感性检测.结果 确认MDCK-S细胞为狗源细胞,且未发现突变、缺失等情况,无其他种属DNA污染.MCB及WCB细胞生长状态良好,生长曲线呈"S"型,倍增时间分别为27.78及27.21h;细菌、真菌及支原体检查均为阴性;细胞形态、结构及细胞膜完整,膜上微绒毛较多,表明细胞状态好,不同细胞代次之间差异较小;具有成瘤性,但不具有致瘤性;染色体2 n=(78±2)条占比为86％～96.19％,P29～P50代细胞染色体数目保持稳定;对流感病毒较敏感.结论 成功将MDCK细胞驯化为悬浮培养,并建立了悬浮细胞系MDCK-S.本研究为细胞基质流感疫苗的研发奠定了基础.

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段.MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产.随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术.通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性.总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具.同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性.

目的 评价H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在无血清悬浮培养MDCK细胞(sMDCK)中的传代稳定性.方法 将H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株工作种子批在sMDCK细胞中连续传15代.采用二代及一代测序法检测主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10和P15代病毒HA、NA、M、NP、NS、PA、PB1、PB2 8段基因核苷酸序列的稳定性;以肽段覆盖率为指标评价工作种子批、P5、P15代病毒主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)蛋白氨基酸序列的稳定性;选取工作种子批、P5和P15代病毒制备流感疫苗,经肌内免疫雌性BALB/c小鼠,每组10只,15 μg HA/只,28 d后加强免疫1次,剂量及给药途径同初次免疫,于初次免疫后28、42、56d,检测血清中和抗体效价,评价免疫原性的稳定性.结果 各代次流感病毒均未检测到片段插入或缺失,核苷酸序列与主种子批序列完全一致;主种子批、工作种子批、P1、P2、P3、P5、P10代病毒均未发生单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)突变,但P15代病毒多个基因位点存在SNP突变的可能性,其中杂合SNP数占91.62％.P5和P15代病毒的HA、NA蛋白肽段覆盖率为96.7％～100％.初次免疫后28、42、56 d,工作种子批、P5和P15代病毒免疫小鼠血清中和抗体效价差异均无统计学意义(H分别为2.253、2.029、1.408、P分别为0.324、0.363、0.495).结论 H5N1(NIBRG-14)流感病毒疫苗株在sMDCK细胞中具有良好的遗传稳定性,有望应用于sMDCK细胞基质大流行流感疫苗的生产.

目的 探讨在悬浮MDCK细胞中培养H7N9禽流感病毒时最佳的TPCK胰酶添加量.方法 在细胞生长期和产毒期,添加不同浓度的TPCK胰酶,每12 h取样监测其对细胞生长的数量、活率、葡萄糖和乳酸的代谢以及血凝滴度的影响,并对TPCK胰酶的批间差异做一探索.细胞生长期胰酶的添加量为0、1、2、4、6、8、10、15μg/ml;产毒期胰酶的添加量为0、0.5、1、1.5、2、2.5μg/ml.出现血凝滴度同等情况时,以MOI为0.001、0.005、0.025、0.05再次进行优化.结果 未见TPCK胰酶浓度对细胞数量、活率、葡萄糖和乳酸代谢明显的线性影响;在TPCK胰酶浓度高达15μg/ml时,也未见其对细胞生长的毒性.接种H7N9禽流感病毒后,1、1.5、2、2.5μg/ml的胰酶添加在48 h都达到了最高的滴度,为1:26.5,在60 h,后两种添加浓度的血凝滴度下降快于前两种添加浓度;MOI为0.005时,1.5μg/ml的胰酶添加在48 h产生的血凝滴度26.5高于同等条件下1μg/ml的26的血凝滴度.在TPCK胰酶不同批次中,有批间差异的存在.结论 1μg/ml和1.5μg/ml的胰酶添加可更好地促进H7N9禽流感病毒增殖,但1.5μg/ml的添加有更广谱的MOI适用性.

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性.方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID50滴度,分析其病毒敏感性.结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×106 cells/mL以上,且差异无统计学意义(P＞0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P＞0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×106 cells/mL接种于5L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×106 cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h-1、(0.028±0.013)h-1、(0.027±0.013)h-1 (p＞0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6～7)log2 HA/25μL、CCID50为(4.35～4.68) lgCCID50/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9～10)log2 HA/25 μL,CCID50为(6.38～7.31) lgCCID50/mL.接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7～9)log2 HA/25μL、CCID50为(6.21～6.96)lgCCID50/mL.结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考.

目的 比较SUS-MDCK、MDCK和SPF鸡胚3种方法对流感样病例(influenza-likeillness,ILI)标本中不同型别流感病毒的分离培养敏感性差异,初步评估SUS-MDCK在流感监测中的应用前景和改进方向.方法 选取2018年10月至2019年6月沈阳市流感监测哨点医院采集的ILl标本中流感病毒核酸阳性的标本,同时应用SUS-MDCK、MDCK和SPF鸡胚3种方法进行病毒分离,对分离结果资料进行比较分析.结果 1 296份ILI标本中,核酸阳性率为15.35％(199/1 296);毒株分离情况为:SUS-MDCK细胞毒株172株、MDCK细胞毒株160株、鸡胚株54株.结论 对于季节性流感病毒的分离培养,细胞法优于鸡胚法;SUS-MDCK和MDCK在分离人季节性流感临床标本的敏感性上,因毒株型别不同而略有差异,H3N2型前者好于后者,甲型H1N1型两者相当,而B型victoria系后者略优于前者.从病毒滴度来看,MDCK细胞毒株和SPF鸡胚毒株相当,但SUS-MDCK细胞毒株高于前两者.

目的 优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件.方法 以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)、胰酶终浓度(2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL)、细胞接毒密度(50× 104、100×104、300×104、500×104、700× 104个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化.同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较.结果 乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10-2、胰酶终浓度为10 μg/mL、细胞接毒密度为300×104个/mL、病毒收获时间为72 h.流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度(CCID50)均明显高于贴壁培养的MDCK细胞(P＜0.05).结论 优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件,为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础.

旨为研究悬浮MDCK细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性与病毒生产稳定性.以悬浮MDCK细胞为研究对象,通过对该细胞进行了长达200多天的传代培养,考察了传代过程中各代次细胞的生长情况以及对H9N2禽流感病毒的生产能力差异;探究了不同培养基稀释比例和MOI等工艺参数条件对长期传代的悬浮MDCK细胞生产H9N2禽流感病毒过程的影响关系;另外,从ROS水平和细胞周期两方面,研究了高低代次细胞的病毒生产能力差异的内在原因.结果显示,各代次悬浮MDCK细胞形态相似,细胞生长能力无显著性差异,表明该细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性良好.但HA滴度随细胞代次的增加而增加,最高代次细胞(P111)的病毒滴度较最低代次细胞(P1)约高0.5 Log2HAU/100μL;P111细胞在不同工艺下病毒产量均高于P1细胞,表明了该细胞长期传代后病毒生产能力略有提高.最后,研究发现,与P1相比,P111胞内ROS水平较低并且G0/G1期细胞的比例较高,此现象可能是高代次细胞产量提高的原因.

为了提升用MDCK悬浮细胞培养生产流感疫苗的效率,克服目前存在的产能低下问题,以期满足日益增长的流感疫苗市场需求和提升应对大流行爆发的能力.通过病毒驯化、稀释流加条件下的细胞生长和产毒能力分析、Semi-perfusion中的细胞高密度培养可行性分析以及ATF灌注反应器过程验证完成过程开发.驯化的病毒加速了其在细胞内的感染扩增,且在稀释流加培养中获得(3.57±0.17)log10(HAU/100μL)的病毒滴度.Semi-perfusion可实现细胞高密度培养至40×106 cells/mL以上,病毒产量达4 log10(HAU/100μL)以上,同时发现MOI和胰酶浓度对病毒的复制过程存在显著影响.在反应器中的ATF灌注培养过程得到了与Semi-perfusion相近的细胞密度及更高的病毒产量4.37 log10(HAU/100μL),并且通过降温措施维持了高密度下的单细胞病毒产量,克服了"细胞密度效应".建立了基于MDCK悬浮细胞ATF灌注培养的流感病毒生产平台,通过同时提高细胞密度和单细胞病毒产率提升了流感病毒的生产效率,为基于细胞培养的流感疫苗产业化生产提供了新选择.