目的:建立H5N1假病毒的体内感染模型，并对抗体FHA3的体内中和活性进行鉴定。方法:依据A/Anhui/1/2005/H5N1毒株血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的序列信息，构建重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1，并与质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293T细胞制备H5N1假病毒上清，电镜观察上清中假病毒颗粒形态。假病毒上清感染MDCK细胞后，测定病毒滴度；经腹腔注射入BALB/c小鼠体内，在感染后2、5、8、12 d进行生物发光成像，检测假病毒体内感染情况。利用建立的小鼠感染模型，评价抗体FHA3的体内功能活性。结果:重组表达质粒pcDNA3.1-HA5和pcDNA3.1-NA1构建正确，与pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞可制备出高滴度的假病毒上清，电镜下可见圆形的病毒颗粒。H5N1假病毒感染后，小鼠体内发出较强的荧光，而攻毒前给予抗体FHA3处理可减弱其荧光信号。结论:成功构建出H5N1假病毒体内感染模型，并证实抗体FHA3对假病毒的感染具有体内保护作用。

目的:在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法:将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中，通过IPTG诱导，在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白，验证表达的准确性，Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白，多剂次免疫家兔，获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时，重组蛋白免疫BALB/c小鼠，评价其免疫原性。结果:rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体，可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体，可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论:本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原，在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体，可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。

目的:构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)和甲型流感病毒双价DNA疫苗，并在小鼠模型中评价其免疫原性。方法:将SARS-CoV-2 Beta突变株S1蛋白编码序列和甲型流感病毒Cambodia (H3N2)株HA蛋白编码序列进行密码子优化合成，采用Over-lapping PCR方法，将两个编码基因通过自裂解2A肽(self-cleaving 2A peptides)序列连接成S1-2A-HA片段，构建能同时表达S1蛋白和HA蛋白的双价DNA疫苗，命名为pVRC-S1-2A-HA，间接免疫荧光和Western blot验证S1蛋白和HA蛋白的表达。将DNA疫苗以肌肉注射加电转途径(IM＋EP)免疫BALB/c小鼠，间接ELISA、假病毒中和试验和血凝抑制试验检测小鼠体液免疫应答，IFN-γ ELISPOT、胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICS)和CBA法检测小鼠细胞免疫应答。结果:双价DNA疫苗pVRC-S1-2A-HA可以同时表达S1蛋白和HA蛋白，初次免疫后能够显著诱导小鼠产生针对S1蛋白的特异性细胞免疫和针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体；加强免疫后特异性免疫应答都显著增强，针对S1蛋白的特异性IgG结合抗体几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)提高至3 251，细胞免疫提高至1 238 SFC/10 6个细胞，针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体GMT达到45 407。ICS法检测到疫苗加强免疫可诱导小鼠CD4 ＋和CD8 ＋T细胞产生IL-2、IFN-γ、TNF-α；CBA结果显示单针免疫后小鼠脾细胞分泌多种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ)。 结论:本研究成功构建能同时表达SARS-CoV-2 S1蛋白和甲型流感病毒H3N2亚型HA蛋白的双价DNA疫苗，该疫苗可诱导产生针对S1蛋白和HA蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫应答，具有较好的研发与应用前景。

目的:比较悬浮细胞MDCK和贴壁细胞MDCK两种培养体系对流感病毒分离培养的差异，探讨悬浮细胞的应用前景。方法:通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率，使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验，连续传代5次后观察血凝效价并对HA和NA基因进行测序，观察基因突变情况。结果:悬浮细胞的24 h、48 h活细胞密度较贴壁细胞更稳定；病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1∶256以上，而贴壁细胞则无滴度；悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变，贴壁细胞两个代次内未发现基因突变，NA基因均未发现基因突变。结论:悬浮MDCK细胞较贴壁细胞生长更为稳定，且病毒分离培养效率高，连续传代病毒突变率低，在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。

目的:构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)和核因子 κB1(nuclear factor kappa B1, NFκB1)基因敲除的犬肾细胞系(Madin-Daby canine kidney cells, MDCK)，对细胞系的生长特性、流感病毒(influenza virus, Flu)的增殖特性进行初步鉴定。 方法:采用CRISPR/Cas9技术，将MDCK细胞的 MAVS和 NFκB1基因敲除，获得稳定的敲除细胞系。接种Flu并检测培养上清中病毒的血凝(hemagglutinination, HA)滴度和TCID 50滴度，与野生MDCK细胞进行比较。 结果:获得2株稳定敲除的MDCK细胞系MDCK- MAVS－和MDCK- NFκB1 －，与野生MDCK细胞同样为贴壁的上皮样细胞。接种Flu后，2株敲除细胞系测定的病毒HA滴度与野生细胞相比无明显差异，TCID 50分别比野生MDCK细胞系提高了9.5倍和10倍，其差异有统计学意义( P＝0.0316)。 结论:本研究构建的2株基因敲除细胞系MDCK- MAVS－和MDCK- NFκB1 －能够提高Flu的感染力，为Flu的分离培养提供了新的候选细胞系。

目的·制备甲型流感病毒H1N1亚型血凝素(hemagglutinin,HA)mRNA疫苗,并探讨不同加强免疫策略的免疫保护作用.方法·以荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)为报告基因,构建Fluc mRNA-脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle,LNP)疫苗,通过小鼠活体成像实验鉴定Fluc mRNA-LNP疫苗肌内注射后在体内的表达情况.进一步构建H1N1亚型(A/Michigan/45/2015)HA(M15-HA)的 mRNA-LNP疫苗,将20、10、5 和 1 μg M15-HA mRNA-LNP疫苗通过肌内注射分别免疫不同剂量组小鼠2次(间隔3周),酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定小鼠第2次免疫2周和4周后血清抗体滴度,血凝抑制试验检测功能性抗体水平.第2次免疫后40d,采用1μgmRNA疫苗或10 μg HA蛋白亚单位疫苗对1 μg剂量免疫组小鼠进行加强免疫,接种2周和4周后用ELISA和血凝抑制试验分别检测特异性抗体及功能性抗体水平.结果·活体成像实验结果显示,小鼠接种Fluc mRNA-LNP疫苗1 d后即能在小鼠体内检测到荧光素酶活性.制备获得的M15-HA mRNA-LNP疫苗2次免疫小鼠2周和4周后,所有剂量组小鼠的特异性抗体水平均较免疫前显著上升(均P=0.000);血凝抑制试验结果显示,20 μg和10 μg剂量组的功能性抗体水平均较PBS对照组显著升高(均P＜0.05).对1 μg低剂量组小鼠进行HA蛋白或M15-HA mRNA-LNP的加强免疫后,均诱导产生了更高水平的特异性抗体和功能性抗体,并能维持较长时间;2种不同加强免疫策略之间差异无统计学意义.结论·成功制备M15-HA mRNA-LNP疫苗,显示出良好的免疫原性和抗体中和活性;低剂量mRNA疫苗免疫2次后,同源mRNA疫苗和异源蛋白疫苗加强免疫均可以诱导更强的免疫反应.

目的 研究黔西南州流感流行特征与鸡胚培养和细胞培养分离毒株在血凝和血凝抑制方面的特性,为流感监测、防控、疫苗研制提供技术支持.方法 收集2021年11月-2022年3月流感监测哨点医院采集的流感样病例样本,经Real-time PCR检测分型,并对乙型流感病毒Victoria系(BV)阳性样本进行鸡胚和细胞分离培养,对培养物进一步进行血凝与血凝抑制试验,然后统计分析其滴度和效价.结果 收集的1 178份标本中,流感阳性353份,阳性率为29.97％,其中BV系占89.52％,且每月均占比最高,季节性H3亚型占10.48％,主要集中在2022年3月.BV系流感鸡胚分离率为20.57％,细胞分离率15.82％.鸡胚分离株红细胞凝集试验(HA)滴度1∶64以上占70.77％(46/65),1∶128 以上占 36.92％(24/65),1∶256 的毒株占 20.00％(13/65),红细胞凝集抑制试验(HI)效价 1∶640以上占 44.62％(29/65),＞1∶1 280 占 4.62％(3/65).而细胞分离株 HA 滴度 1∶64 以上占 52.00％(26/50),1∶128 以上仅占10.00％(5/50),1∶256毒株为0株;HI效价1∶640以上占14.00％(7/50),＞1∶1 280有0株.结论 黔西南州2021年11月-2022年3月以BV系流感为优势流行型别,鸡胚分离和细胞分离可相互补充,鸡胚分离株HA滴度和HI效价整体上比细胞分离毒株高.

目的 利用昆虫杆状病毒表达系统表达H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因,获得重组HA蛋白,并验证其活性.方法 全基因合成H7N9禽流感病毒全长HA基因,将HA基因进行扩增并克隆到pFastBacI载体中,构建重组杆状病毒表达载体,经PCR鉴定后将其转染昆虫sf9细胞,再采用SDS-PAGE实验和免疫印迹法检测重组HA蛋白的表达.HA蛋白经纯化后,采用血凝试验鉴定其红细胞凝集活性.结果 PCR结果显示重组杆状病毒表达载体的扩增产物大小约为4000 bp,SDS-PAGE电泳显示纯化的表达蛋白分子量为63 KD,免疫印迹检查结果显示表达蛋白可以与特异性HA抗体进行反应,产生条带与理论大小相当.血凝试验结果显示表达的蛋白能使红细胞凝集,滴度为1:64.结论 禽流感H7N9的HA蛋白在重组杆状病毒中获得表达,并具有血凝活性.

目的:评价白及提取物体外抗流感病毒药效及研究其机理.方法:以病毒血凝效价及核酸量为指标,评价白及提取物在鸡胚模型的抗流感病毒作用.以流感病毒致细胞病变效应(eytopathic effect,CPE)及血凝抑制试验(HI)为指标,评价白及提取物抑制流感病毒的入侵作用及作用靶点.以CPE及病毒RNA合成量为指标,评价白及提取物对病毒复制及RNA合成的抑制作用.神经氨酸酶抑制(NAI)试验测定白及提取物对病毒NA活性的抑制作用.结果:鸡胚模型中,白及提取物各剂量组血凝滴度以及病毒核酸量与病毒对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).细胞实验中,白及水提物和醇提物均具有较好的抗病毒入侵效果,抑制率最高分别达到(87.04±7.81)％和(60.14±6.88)％;水提物通过干预MDCK细胞HA受体阻止病毒的入侵.白及水提物和白及醇提物均具有较好的抗流感病毒复制效果,与病毒对照组比较,白及提取物可显著降低病毒RNA的合成(P＜0.01).醇提物具有较好的神经氨酸酶抑制活性,NA-IC50为16.0 mg/mL.结论:白及提取物通过抑制流感病毒与HA受体结合、干预病毒RNA合成及抑制神经氨酸酶活性发挥抗流感病毒作用.

目的 评估老年高剂量四价流感病毒裂解疫苗(A+B套苗)的免疫原性.方法 采用江苏金迪克生物技术有限公司研发的四价流感病毒裂解疫苗,以小鼠为动物模型进行免疫原性试验,测定各组抗血凝素抗体滴度,比较高剂量A+B套苗与其他组疫苗的免疫原性差别.结果 血凝抑制试验结果表明,高剂量单次免疫组对四型抗原的血凝抑制滴度均高于标准剂量单次免疫组;高剂量A+B套苗的研究中,除高剂量先B苗后A苗组中抗A3的血凝素抗体滴度未显著增加外,其他各组高剂量两次免疫组血凝素抗体滴度均显著高于标准剂量两次免疫组(P＜0.001).同时发现,不论高剂量还是标准剂量的A+B套苗组中,先B苗后A苗组中抗A型的血凝素抗体滴度明显高于先A苗后B苗组;先A苗后B苗组中,抗B型的血凝素抗体滴度明显高于先B苗后A苗组.在高剂量A+B套苗两次免疫时间的间隔对抗血凝素抗体产生的影响试验中,7d与10 d免疫间隔的免疫效果优于3d.结论 高剂量四价老年流感疫苗(A+B套苗)分两次注射、免疫间隔7～10d的方式免疫效果最好,在流感季节可根据A型和B型流感病毒流行监测结果,选择或改变先A苗后B苗或先B苗后A苗使用程序,以增加对人群的保护,是预防老年流感的新方法.