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PDK1-Akt信号通路干预对心肌细胞HCN4离子通道的影响
编辑人员丨1周前
目的:探讨3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1-蛋白激酶B(PDK1-Akt)信号通路干预对心肌细胞超极化激活环核苷酸门控离子通道4(HCN4)转录、表达及功能的影响。方法:使用酶解法从健康雄性野生型C57小鼠和心脏特异性敲除PDK1小鼠获得心房肌细胞,分别为空白对照组和PDK1-KO组;另外,对急性分离自C57小鼠的心房肌细胞进行培养,将其分为药物对照组[予二甲基亚砜(DMSO)干预)]、PDK1敲低组[予1 μg/ml PDK1的短发夹状RNA(shRNA)干扰质粒干预]、SC79组[予Akt激动剂SC79(8 μmol/ml)干预]、GSK2334470组[予PDK1抑制剂GSK2334479(10 nmol/ml)干预]和PDK1敲低+SC79组(予8 μmol/ml SC79和1 μg/ml PDK1的shRNA干扰质粒干预)。为进一步减少药物脱靶的可能,故运用PDK1的shRNA质粒转染培养的心肌细胞,并在此基础上加用SC79干预。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相应组心房肌细胞PDK1及HCN4的mRNA表达水平,Western blot检测PDK1、Akt及HCN4蛋白表达水平,全细胞膜片钳检测HCN的电流密度,免疫荧光技术检测HCN4蛋白表达情况。结果:(1)PDK1-KO组的HCN4的mRNA(1.46±0.03比0.99±0.01, P<0.001)及蛋白(1.14±0.02比1.00±0.06, P=0.017)表达水平高于空白对照组。全细胞膜片钳结果显示,PDK1-KO组的HCN电流密度大于空白对照组[(-17.47±2.00)pA/pF比(-12.15±2.25)pA/pF, P=0.038]。(2)通过比较PDK1敲低组、SC79组和药物对照组细胞,对PDK1 shRNA及Akt特异性激动剂SC79进行功能验证,结果显示PDK1敲低组细胞的PDK1 mRNA及蛋白表达水平低于药物对照组,SC79组细胞的磷酸化-Akt(Thr 308)蛋白表达水平高于药物对照组。(3)GSK2334470组细胞的HCN4 mRNA(3.61±0.46比1.00±0.08, P<0.001)及蛋白(2.33±0.11比1.00±0.05, P<0.001)表达水平高于药物对照组。(4)PDK1敲低组细胞的HCN4 mRNA表达水平高于药物对照组(1.76±0.11比1.00±0.06, P<0.001)及PDK1敲低+SC79组(1.76±0.11比1.33±0.07, P=0.003),PDK1敲低+SC79组的HCN4 mRNA表达水平亦高于药物对照组(1.33±0.07比1.00±0.06, P<0.001)。PDK1敲低组细胞的HCN4蛋白表达水平高于药物对照组(1.15±0.04比1.00±0.05, P=0.003),PDK1敲低+SC79组的HCN4蛋白表达水平与药物对照组比较差异无统计学意义( P>0.05),但低于PDK1敲低组(0.95±0.01比1.15±0.04, P<0.001)。全细胞膜片钳实验结果示,药物对照组细胞的HCN电流密度为(-13.27±1.28)pA/pF,PDK1敲低组细胞为(-18.76±2.03)pA/pF,PDK1敲低+SC79组细胞为(-13.50±2.58)pA/pF;PDK1敲低组细胞的HCN电流密度大于药物对照组( P<0.001),而PDK1敲低+SC79组与药物对照组比较差异无统计学差异( P>0.05)。(5)免疫荧光检测结果显示PDK1敲低组的绿色荧光较药物对照组增强,提示定位于细胞膜的HCN4表达量增加。而PDK1敲低+SC79组的绿色荧光较PDK1敲低组减弱,提示当敲低PDK1后再进一步激动Akt,定位于细胞膜HCN4表达量下降。 结论:PDK1-Akt信号通路参与心肌细胞HCN4离子通道转录、表达水平及功能的调控。
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编辑人员丨1周前
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纹状体HCN4通道在紫杉醇诱发大鼠神经病理性痛中的作用:与GABA B受体的关系
编辑人员丨1周前
目的:评价纹状体超极化激活环核苷酸门控通道(HCN通道)在紫杉醇诱发大鼠神经病理性痛中的作用及其与GABA B受体的关系。 方法:清洁级健康雄性SD大鼠,6~9周龄,体重180~220 g。腹腔注射紫杉醇2 mg/kg,每2 d注射1次,连续7 d,制备神经病理性痛模型,随后行鞘内置管术。选取鞘内置管术成功的大鼠50只,采用随机数字表法分为5组( n=10):紫杉醇组(P组)、紫杉醇+生理盐水组(N组)、紫杉醇+慢病毒空载体组(BV组)、紫杉醇+HCN4通道慢病毒组(H组)和紫杉醇+HCN通道阻断剂ZD7288组(I组)。选取10只同龄大鼠作为空白对照组(C组)。腹腔注射紫杉醇后15 d时,N组鞘内注射生理盐水20 μl,BV组鞘内注射HCN4通道慢病毒空载体1×10 8 TU/ml(20 μl),H组鞘内注射HCN4通道慢病毒1×10 8 TU/ml(20 μl),I组鞘内注射ZD728830 μg(20 μl)。腹腔注射紫杉醇前1 d和注射后14、21 d时测定机械缩足反应阈(MWT)。于T 2时取大脑纹状体组织,采用免疫组织化学法和Western blot法测定HCN4通道和GABA B受体表达水平。 结果:与C组比较,P组MWT降低,HCN4通道表达上调,GABA B受体表达下调( P<0.05);与P组比较,H组和I组MWT升高,HCN4通道表达下调,GABA B受体表达上调( P<0.05),N组和BV组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:纹状体HCN4通道表达上调可诱导GABA B受体表达下调,参与紫杉醇诱发大鼠神经病理性痛的病理生理机制。
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编辑人员丨1周前
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紫杉醇诱发痛大鼠脊髓背角超极化活化环核苷酸门控通道4的表达及其与γ-氨基丁酸B型受体的关系
编辑人员丨1周前
目的:探讨紫杉醇诱发神经痛大鼠脊髓背角超极化活化环核苷酸门控通道4(HCN4)的表达变化及其与γ-氨基丁酸B型(GABAB)受体的关系。方法:清洁级SD雄性大鼠(购自河北医科大学动物实验中心),69周龄,体重180~220 g。于实验开始第1、3、5、7 d分别腹腔注射紫杉醇2 mg/kg制备神经痛模型,行鞘内置管术成功后,随机数字表法将其分为5组( n=10):紫杉醇模型组(P组),紫杉醇模型+生理盐水组(N组),紫杉醇模型+慢病毒空载体组(BV组),紫杉醇模型+HCN4通道慢病毒组(H组),紫杉醇模型+ZD7288组(I组),10只同龄大鼠作为空白对照组(C组)。腹腔注射紫杉醇后15 d鞘内注射药物20 μl:N组注射生理盐水,BV组注射慢病毒空载体(1×10 8 TU/ml),H组注射HCN4通道慢病毒(1×10 8 TU/ml)。腹腔注射紫杉醇后21 d鞘内注射药物20 μl:I组注射HCN4通道抑制剂ZD7288(30 μg)。腹腔注射紫杉醇前1 d(T0)、注射后第14天(T1)、第21天(T2)时点分别测定50%机械缩足反应阈(MWT)。于T2时点取脊髓背角组织标本,采用免疫组织化学法和蛋白质印迹法(Western blot)法测定HCN4通道和GABAB受体的蛋白表达水平。测量数据采用均值±标准差( Mean± SD)表示,组内比较采用重复测量设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析。 结果:与T0时点[(15.4±2.7)、(14.8±2.1)、(14.6±2.1)、(14.2±2.2)、(15.2±2.1) g]比较,P组、N组、BV组、H组、I组T1时[(4.8±1.3)、(4.7±1.5)、(4.8±1.1)、(5.0±1.3)、(4.8±1.3) g] MWT均降低( t=11.326、12.177、12.932、11.298、13.449, P<0.05),差异有统计学意义;与T1时点比较,H组、I组T2时点[(9.9±1.0)、(10.3±1.5) g]MWT均升高( t=9.389、9.006, P<0.05),差异有统计学意义。与C组[(14.4±2.6) g]比较,T1时点P组、N组、BV组、H组、I组MWT均降低( t=10.394、10.009、10.537、10.117、10.335, P<0.05),差异有统计学意义;与P组[(5.2±1.7) g]比较,T2时点H组和I组[(9.9±1.0)、(10.3±1.5) g]MWT均升高( t=7.440、7.212, P<0.05),差异有统计学意义。与C组[(0.24±0.03)、(0.75±0.05) g]比较,T2时点P组脊髓背角HCN4通道蛋白表达(0.86±0.09)升高、GABAB受体蛋白表达(0.25±0.03)降低( t=14.980、20.325, P<0.05),差异有统计学意义;与P组比较,T2时点H组、I组脊髓背角HCN4通道蛋白表达(0.13±0.04、0.18±0.03)降低、GABAB受体蛋白表达水平(0.91±0.03、0.79±0.03)升高( t=16.934、16.473、33.335、28.412, P<0.05),差异有统计学意义。免疫组织化学法测定蛋白的光密度值与Western blot法测定结果一致。 结论:紫杉醇可通过大鼠脊髓背角HCN4通道蛋白表达水平升高,促使GABAB受体蛋白表达下调,从而诱发神经病理性痛。
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编辑人员丨1周前
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电针通过抑制PDK1/Akt/HCN4通路改善大鼠神经源性尿潴留
编辑人员丨2023/11/11
目的:以3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)/蛋白激酶B(Akt)/超极化激活环核苷酸门控离子通道4(HCN4)通路为切入点,探究电针治疗大鼠神经源性尿潴留的分子机制.方法:实验选取SD雌性大鼠,采用改良Hassan Shaker脊髓全断法建立逼尿肌无力型尿潴留大鼠模型,并按随机数字表法随机分为模型组、电针组、PDK1抑制剂组、HCN4阻断剂组、电针+HCN4阻断剂组,每组20只,另取20只大鼠作为假手术组.电针组、电针+HCN4阻断剂组取大鼠"中极""中髎"电针治疗20 min,1次/d,PDK1抑制剂组隔天1次腹腔注射OSU-03012(20 mg/kg),HCN4阻断剂组隔天1次腹腔注射伊伐布雷定(10 mg/kg),以上治疗均持续10 d.多通道生理记录仪检测大鼠尿流动力学指标;肌条实验检测逼尿肌兴奋性;HE染色观察膀胱形态学变化;免疫荧光双染法检测膀胱组织HCN4与酪氨酸蛋白激酶KIT(C-Kit)阳性表达;Western blot法检测膀胱组织PDK1/Akt/HCN4通路蛋白及热休克蛋白27(HSP27)表达.结果:与假手术组相比,模型组大鼠出现排尿功能障碍,漏尿点压力、离体逼尿肌自发收缩频率、膀胱组织C-Kit荧光强度、HCN4+/C-Kit+共表达、HCN4及磷酸化(p)-HSP27/HSP27蛋白表达降低(P<0.05),膀胱最大容量及顺应性、离体逼尿肌收缩时最小张力、膀胱组织PDK1及p-Akt/Akt蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,电针组、PDK1抑制剂组大鼠以上指标均逆转(P<0.05);与电针组相比,电针+HCN4阻断剂组和HCN4阻断剂组大鼠排尿功能障碍严重,漏尿点压力、自发收缩频率、C-Kit荧光强度、HCN4+/C-Kit+共表达、HCN4 及p-HSP27/HSP27蛋白表达降低(P<0.05),膀胱最大容量及顺应性、离体逼尿肌收缩时最小张力、膀胱组织PDK1及p-Akt/Akt蛋白表达升高(P<0.05).HE染色示模型组大鼠膀胱上皮组织脱落、层次紊乱,膀胱壁细胞空泡化、黏膜层及肌层中性粒细胞浸润等病理损伤明显,电针组及PDK1抑制剂组有所减轻,HCN4阻断剂组较模型组加重,电针+HCN4阻断剂组上述病理损伤较电针组严重.结论:电针刺激"中髎""中极"可能通过抑制PDK1/Akt通路活化,促进HCN4介导的逼尿肌兴奋性收缩、排尿电信号活化,从而改善神经源性尿潴留大鼠排尿功能障碍.
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编辑人员丨2023/11/11
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超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4在大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞中的表达
编辑人员丨2023/8/26
目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在大鼠体内和体外心肌成纤维细胞、心肌细胞中的表达分布及其增龄变化.方法:SD大鼠分为新生组(1~3 d),成年组(17个月)和老年组(22个月),每组8只,其中4只用于冰冻切片,另4只用于PCR;取新生SD大鼠心,酶消化法分离培养原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞.用免疫荧光、免疫组织化学检测原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞HCN4的表达;免疫印迹、实时荧光定量PCR检测原代心肌成纤维细胞HCN4的表达,用实时荧光定量PCR检测不同月龄大鼠心肌组织HCN4的表达.结果:体外细胞培养显示,成纤维细胞和原代心肌细胞中均表达HCN4.组织切片显示,新生、成年和老年大鼠心肌成纤维细胞和部分心肌细胞表达HCN4.P1~P4代成纤维细胞的免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示HCN4随着成纤维细胞代次增加,表达量逐渐降低;不同月龄大鼠左心室的实时荧光定量PCR结果显示随着大鼠月龄增加,HCN4的表达量逐渐降低,其结果与培养的细胞表达一致.结论:HCN4在心肌成纤维细胞和部分心肌细胞中表达.随增龄变化,心肌细胞和成纤维细胞HCN4的表达量逐渐下降.
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编辑人员丨2023/8/26
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超极化激活环核苷酸门控通道在人肺组织中的表达及功能
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨超极化激活环核苷酸门控(HCN)通道在人肺组织标本及人肺上皮细胞系中的表达情况,并进行相关功能学研究.方法 收集临床肺癌手术患者癌旁正常肺组织标本,体外培养人肺上皮H441.采用聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹技术检测入肺组织标本和人肺上皮细胞中HCN通道的表达水平.应用尤斯灌流室实验装置测定H441单层细胞的短路电流,检测HCN通道的相关功能.结果 聚合酶链反应结果显示,HCN 4和HCN 1通道扩增产物经琼脂糖凝胶电泳出现116 bp和91 bp的目的条带,HCN 4和HCN 1亚型在人肺组织和H441细胞系中均有mRNA水平的表达,而HCN 2和HCN 3亚型未见表达.用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,在99 000和130000分别出现HCN 4和HCN 1的目的条带,HCN 4和HCN 1亚型在人肺组织和H441细胞系中均有表达,HCN 2和HCN 3亚型未见表达.尤斯灌流室系统测定短路电流的变化,3、10、30、100、300 μmol/L的ZD7288能够剂量依赖性抑制人H441单层细胞的短路电流,根据Boltzmann方程拟合后的半数抑制率为85.8 μmol/L.结论 HCN 4/1通道亚型在人肺组织中具有组织和功能学表达,为临床寻求合适药物治疗肺脏相关疾病提供了理论基础.
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编辑人员丨2023/8/6
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持续性心房颤动模型犬左心房肌HCN2和HCN4通道表达变化
编辑人员丨2023/8/6
目的 研究持续性心房颤动(房颤)形成过程中,心房肌超极化激活环核苷酸门控(HCN)2和HCN4通道的变化.方法 12只家犬分为两组,其中持续性房颤模型犬6只(实验组,通过使用右心房快速起搏8 w获得),窦性心律模型犬6只(对照组).采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹的方法检测左心房肌HCN2通道和HCN4通道的mRNA和蛋白的表达含量.结果 与对照组相比,实验组左心房肌HCN2和HCN4 mRNA表达水平呈明显增高的趋势(P<0.05),并且其相应蛋白质表达含量也呈明显增高趋势(P<0.05).结论 持续性心房颤动模型犬左心房肌HCN2和HCN4表达增高,提示HCN2和HCN4通道参与持续性房颤心房电重构.
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编辑人员丨2023/8/6
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大鼠右冠状动脉右缘支结扎制备心动过缓模型
编辑人员丨2023/8/6
目的 制备与临床发病机制相关且重现性好的缺血性心动过缓模型.方法 雄性SD大鼠18只,随机分为左冠状动脉结扎组、右冠状动脉结扎组和假手术组,每组6只.麻醉开胸,心电图监护下结扎左、右冠状动脉分支,分别在术后第5天(d5),d10和d15记录Ⅱ导联心电图,观察心电图和心率的变化;d16测量大鼠血流动力学参数,评价大鼠心功能;大鼠处死后,剪取含窦房结的右心房组织,HE和Masson染色观察右心房组织形态改变;Western蛋白印迹法测定右心房钠钙交换蛋白1(NCX1)和超极化激活环核苷酸门控阳离子通道亚型4(HCN4)蛋白的表达.结果 与假手术组相比,结扎左、右冠状动脉大鼠心电图ST段均抬高(P<0.01),右冠状动脉结扎上升幅度较左冠状动脉结扎小(P<0.01);右冠状动脉结扎大鼠术后心率持续降低,d10后心率低于假手术对照组(P<0.05);左冠状动脉结扎大鼠术后心率呈升高回落趋势,d5心率高于假手术对照组(P<0.05),然后回落,d15回落到假手术组水平;左冠状动脉结扎后15d,大鼠左心室内压最大下降速率明显下降(P<0.01),左心室终末舒张压显著上升(P<0.01);右冠状动脉结扎术对血流动力学指标均无明显影响.组织形态检查结果显示,右冠状动脉结扎引起右心房炎性浸润和纤维化更为明显(P<0.01);Western蛋白印迹结果显示,右心房组织(包含窦房结)NCX1和HCN4表达显著降低(P<0.05).结论 大鼠右冠状动脉结扎,引起右心房缺血性改变,成功制备了缺血性心动过缓模型.
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编辑人员丨2023/8/6
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ISL-1和Tbx18联合转染对乳鼠心室肌细胞重编程的作用研究
编辑人员丨2023/8/6
目的:探讨ISL-1和 T bx18联合转染对乳鼠心室肌细胞重编程的作用,及能否在体外构建生物起搏点. 方法:将乳鼠心室肌细胞随机分成空白对照组、GFP组、ISL-1组、T bx18组、ISL-1+ T bx18组,分别转染相应病毒,培养5~7 d后 qRT-PCR 、Western blot和免疫荧光检测超极化激活环核苷酸门控离子通道蛋白亚型4(HCN4)的表达情况,观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动. 结果:ISL-1组、Tbx18组和ISL-1+ Tbx18组的细胞搏动频率和 HCN4的mRNA 和蛋白表达水平较空白对照组和 GFP组明显升高,其中ISL-1+ Tbx18组的细胞搏动频率和HCN4的mRNA和蛋白表达水平明显高于ISL-1组和Tbx18组(P均<0 .05).通过免疫荧光技术,ISL-1组和T bx18组可检测到HCN4不连续表达,ISL-1+ T bx18组 HCN4连续高表达.通过膜片钳技术,ISL-1组和T bx18组均仅有少数细胞可记录到起搏电流活动,而ISL-1+ T bx18组大多数细胞可记录到起搏电流活动. 结论:ISL-1和 T bx18联合表达能提高乳鼠心室肌细胞重编程为起搏样细胞的效率.
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编辑人员丨2023/8/6
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不同发育时段大鼠心肌组织中超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4阳性细胞的分布特征
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在不同发育时期大鼠心肌组织中各类细胞的表达规律,为进一步研究HCN4对心肌的作用提供形态学依据.方法 出生1d、1月、3月、6月健康SD大鼠各15只.取新鲜心脏,石蜡切片和冷冻切片,利用免疫组织化学和荧光技术观察不同发育时段大鼠心肌组织HCN4阳性细胞的表达分布情况及形态学特征.利用Western blotting技术观察左右心室HCN4的蛋白含量.结果 免疫组织化学和荧光染色结果显示,HCN4阳性细胞在出生后1d、1月、3月、6月的血管平滑肌细胞,心内膜和血管的内皮细胞,心外膜的间皮细胞、成纤维细胞,大量心房肌细胞和少量心室肌细胞、传导组织细胞均有表达,但不同部位的表达细胞数量不均;Western blotting结果显示,心室HCN4蛋白随着月龄的增加表达逐渐降低.结论 HCN4在大鼠心肌组织中的表达随年龄的增加逐渐下降,但增殖能力较强的细胞持续存在,提示HCN4可能对心肌组织中的多种细胞的生存起调控作用.
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编辑人员丨2023/8/6
