目的:探讨清解扶正颗粒(QFG)对人结直肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞的逆转作用机制.方法:培养人结直肠癌HCT-8细胞及HCT-8/5-FU耐药细胞,计算不同化疗药物的耐药指数(RI)和QFG的逆转倍数(RF);设立空白对照组(0 mg/mL)和不同浓度(0.25、0.5、1.0 mg/mL)QFG干预组;各组干预48 h后,通过罗丹明-123(Rho123)染色和多柔比星(DOX)染色检测细胞外排泵功能,通过克隆形成试验检测细胞存活能力,应用磷脂酰丝氨酸(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染检测细胞凋亡,应用Cyto-ID染色检测细胞自噬,应用蛋白质印迹法检测P-糖蛋白(gP)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、选择性自噬接头蛋白(p62/SQSTM1)、微管相关蛋白1轻链(LC)3 Ⅱ的蛋白表达.结果:HCT-8/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星(DOX)和顺铂(DDP)均耐药,QFG可有效逆转化疗耐药,与空白对照组比较,不同浓度QFG显著增加Rho123、DOX和Cyto-ID的平均荧光强度(均P＜0.05);抑制细胞的克隆形成率(P＜0.05),提高细胞凋亡率(P＜0.05);和空白对照组比较,QFG抑制P-gP、p62的蛋白表达(P＜0.05),降低Bcl-2/Bax比值(P＜0.05),促进LC3-Ⅱ的蛋白表达(P＜0.05).结论:QFG促进细胞凋亡和自噬,抑制耐药细胞对化疗药物的外排泵功能,从而逆转多药耐药.

目的 通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶 2(fucosyl-transferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系.方法 构建FUT2 慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000 将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2 包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2 细胞系.PCR鉴定FUT2 基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2 细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2 细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性.结果 成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2 细胞系,PCR验证显示,FUT2 基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中.HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA水平提高了 330 倍.99.9%的HEK-293T/FUT2 细胞表达H2 型人类组织血型抗原.GI.1 重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2 细胞产生很好的结合反应,EC50为 2.007 μg/mL.结论 建立了H2 型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1 型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法.

目的:探讨伴有核极向倒置特征的乳头状肾肿瘤（papillary renal neoplasm with reverse polarity，PRNRP）临床病理特征、免疫表型、分子改变及预后。方法:对解放军东部战区总医院病理科2013—2019年诊断的9例PRNRP进行光镜观察、免疫组织化学、荧光原位杂交、基因测序等，并进行随访，复习相关文献。结果:患者男性5例，女性4例，年龄49~70岁，平均年龄60.1岁，平均随访29个月，1例因其他原因死亡，其余均无病生存。镜下肿瘤细胞排列成具有纤维血管轴心的乳头状，表面覆盖单层立方或柱状细胞，胞质颗粒嗜酸性，最突出的特点是肿瘤细胞核位于远离基底膜的胞质顶部，且大小一致，排列整齐，未见或极少见核仁。9例PRNRP免疫组织化学均弥漫阳性表达细胞角蛋白7、E-cadherin，不同程度表达P504s，CD10和CD117阴性，Ki-67阳性指数1%~3%，与普通乳头状肾细胞癌不同，9例PRNRP均特征性的阳性表达GATA3。荧光原位杂交检测，8例PRNRP不存在第7、17号染色体三倍体。KRAS基因测序证实8/9例中存在KRAS基因错义突变。结论:PRNRP是一种具有可被识别的形态学特征的乳头状肾细胞癌亚型，并具有特征性的免疫表型和分子改变，生物学行为惰性，是否将其定义为“癌”还需要更多的数据积累，明确诊断PRNRP对患者的治疗方案选择以及预后预测具有重要意义。

目的:借助网络药理学方法并结合动物实验预测鼻敏康颗粒治疗变应性鼻炎的分子机制。方法:借助TCMSP、OMIM、GeneCards、TTD、DrugBank、PharmGKB数据库筛选鼻敏康颗粒的活性成分靶点及变应性鼻炎靶点；运用R语言软件对药物和疾病靶点映射取交集；采用Cytoscape 3.8.0软件、STRING数据库构建交集靶点PPI网络，并进行网络拓扑学分析；利用DAVID数据库进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，并对主要活性成分与关键靶点进行分子对接验证。将32只大鼠按随机数字表法分为空白组8只和造模组24只。造模组大鼠经卵清蛋白诱导建立变应性鼻炎模型。将造模成功的24只SD大鼠按随机数字表法分为模型组、西药组、鼻敏康颗粒组，每组8只。西药组灌胃氯雷他定药液1 mg/kg，鼻敏康颗粒组灌胃鼻敏康颗粒药液4.1 g/kg，空白组与模型组大鼠灌胃等体积的生理盐水，1次/d，连续2周。观察并记录30 min各组大鼠鼻炎症状，采用HE染色观察大鼠鼻黏膜病理改变，ELISA法检测大鼠血清中IL-17、IL-6水平，Western blot法测定大鼠鼻黏膜组织中TNF、STAT3蛋白表达。结果:预测到鼻敏康颗粒治疗变应性鼻炎靶点41个，PPI网络拓扑学分析得到TNF、STAT3等核心靶点，GO生物过程涉及药物反应、炎症反应、细胞因子反应等，KEGG通路主要富集于Th17细胞分化、脂质和动脉粥样硬化、IL-17、Toll样受体等通路。分子对接结果显示，主要活性成分与关键靶点结合活性良好。动物实验表明，鼻敏康颗粒可改善变应性鼻炎大鼠鼻炎症状，下调血清IL-17、IL-6表达，抑制TNF-α、STAT3蛋白表达。结论:鼻敏康颗粒可通过多个活性成分、多靶点、多通路治疗变应性鼻炎，其机制可能与调控Th17细胞分化通路相关蛋白有关。

目的:观察前列腺癌（PCa）患者CD8 + T细胞中Notch受体的表达，分析Notch信号通路对PCa患者CD8 + T细胞功能的影响。 方法:收集2017年11月至2018年6月在山西省人民医院就诊的PCa患者45例、无菌性前列腺炎患者41例和健康对照者30名。分选外周血CD8 +T细胞，反转录实时定量PCR法检测CD8 + T细胞中Notch1~4 mRNA相对表达量。使用Notch信号通路抑制剂γ-分泌素抑制剂（GSI）刺激CD8 + T细胞，反转录实时定量PCR法检测穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA相对表达量变化，流式细胞术检测抗程序性死亡分子（PD）-1和CTLA-4阳性细胞比例变化。建立CD8 + T细胞与PCa细胞系LAPC4细胞的直接接触和间接接触培养体系，通过检测靶细胞的死亡比例和细胞因子分泌评估抑制Notch信号通路对CD8 +T细胞的杀伤功能的影响。组间比较采用单因素方差分析、LSD- t检验或配对 t检验。 结果:PCa患者CD8 +T细胞中Notch1~4 mRNA相对表达量（5.22±1.04、2.79±0.91、9.74±3.38、1.63±0.82）显著高于健康对照者（0.87±0.17、1.03±0.17、1.24±0.21、1.26±0.08）和无菌性前列腺炎患者（0.87±0.15、1.05±0.14、1.27±0.19、1.26±0.16）（均 P<0.05）。PCa患者CD8 +T细胞存在功能衰竭，主要表现为穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA相对表达量降低（均 P<0.000 1），PD-1：19.3%±5.4%和CTLA-4：11.7%±3.9%阳性细胞比例升高，直接接触共培养体系中PCa患者CD8 +T细胞诱导LAPC4细胞死亡比例下降（28.8%±6.4%比37.2%±2.6%， P=0.015），γ干扰素（IFN）-γ分泌水平降低[（61.7±10.6）ng/L比（88.6±20.2）ng/L， P=0.003 2]。使用GSI抑制Notch信号通路可增强PCa患者CD8 +T细胞中穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA相对表达量（均 P<0.01），PD-1 +CD8 +T细胞和CTLA-4 +CD8 +T细胞的比例降低。抑制Notch信号通路可增强直接接触共培养体系中PCa患者CD8 +T细胞诱导LAPC4细胞死亡比例（34.3%±7.2%， P=0.000 2），IFN-γ分泌水平亦升高[（88.4±33.6）ng/L， P=0.008 3]。 结论:PCa患者Notch受体表达升高诱导CD8 +T细胞功能衰竭。

目的:建立中国汉族女性转移性黑素瘤来源的黑素瘤细胞系，并研究其基本生物学特性。方法:从1例17岁女性恶性黑素瘤患者腋窝淋巴结分离转移细胞体外培养，建立细胞系。通过短串联重复序列（STR）基因型检测对比细胞系与其来源组织信息，并检测基因突变情况；CCK8实验检测细胞增殖，软琼脂克隆实验检测细胞锚定非依赖性恶性增殖能力；染色体核型分析确定染色体数量及结构；以高侵袭性黑素瘤细胞系A2058、角质形成细胞系HaCaT细胞为对照，通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力差异，细胞免疫荧光和Western印迹检测黑素瘤特异性标记物HMB45、S100、Melan-A蛋白表达情况；通过裸鼠荷瘤，观察在体内的致瘤性。结果:成功建立1株黑素瘤细胞株，命名为ZJMM-45，在超1年的时间中培养70余代次，显示出稳定的形态和增殖，细胞呈梭形、多角形，可产生黑素颗粒。STR匹配分析显示，样本ZJMM-45与患者冻存淋巴结组织匹配度96%，为同一来源。ZJMM-45细胞系存在肿瘤相关基因突变位点BRAFV600E（c.1799 T>A）；染色体核型分析显示，ZJMM-45细胞染色体多为三倍体，呈异常结构。ZJMM-45体外培养呈指数增长，至第5天达到平台期；在琼脂中呈克隆样生长并形成克隆球，显示出锚定非依赖性和恶性增殖能力。细胞免疫荧光和Western印迹结果显示，ZJMM-45与A2058细胞均表达HMB45、S100和Melan-A；Transwell实验显示，ZJMM-45侵袭、迁移细胞数量（300 ± 14、260 ± 14）均高于A2058细胞（150 ± 6、160 ± 19， t = 13.25、11.76， P < 0.001）。裸鼠荷瘤实验4周后5只小鼠均发展成内径为1.0 cm的肿瘤，病理组织学特征包括增殖性黑素瘤细胞核深染，形成小巢，与原实体瘤相似。 结论:成功构建1株来源于中国黑素瘤患者的转移期细胞系ZJMM-45，携带BRAFV600E突变，表达黑素瘤特异性标记物，在体外培养中有快速增殖、侵袭、转移等多种恶性特点，体内实验有明显致瘤性。

目的:分析胃癌患者血清外泌体中miRNA－21的表达水平及其与患者临床病理学特征及预后的关系。方法:利用外泌体试剂盒提取52例胃癌患者和10名健康人血清中的外泌体，并通过Western blot和纳米颗粒示踪法对其进行验证。采用RT－qPCR检测外泌体中miRNA－21的表达水平，分析其与胃癌患者临床病理学特征及预后的关系。结果:胃癌患者血清外泌体中miRNA－21的表达水平较正常人明显升高(2.59±0.12比1.16±0.10, t＝5.168, P<0.05)，其高表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、脉管浸润、神经侵犯及TNM分期均有关(均 P<0.05)。外泌体miRNA－21高表达组胃癌患者的总生存期较低表达组胃癌患者短(χ 2＝14.573， P<0.05)。多因素分析显示，血清外泌体中miRNA－21高表达是影响胃癌患者预后的独立因素( HR＝2.863，95% CI: 1.063～7.712， P＝0.038)。 结论:胃癌患者血清外泌体中miRNA－21表达上调，并且其高表达与多种不良的临床病理因素及患者的不良预后有关。

目的:探讨CD8 ＋T细胞在抵抗致死型约氏疟原虫17XL( Plasmodium yoelii 17XL, Py 17XL)感染中的作用。 方法:对BALB/c和C57BL/6小鼠腹腔接种 Py 17XL感染红细胞(1×10 6个/0.1 ml)，建立疟原虫感染模型。动态监测小鼠红细胞感染率、生存率。流式细胞术检测CD8 ＋T细胞亚群效应T细胞(T EFF)和记忆T细胞(T CM)数量，检测IFN-γ和颗粒酶B(granzyme B，GB)表达水平，及CD8 ＋T细胞表面CXCR3、CXCR6和CX3CR1表达水平。对 Py 17XL感染C57BL/6小鼠进行FTY720阻断试验，分析CD8 ＋T细胞迁移对 Py 17XL感染的影响。 结果:BALB/c小鼠红细胞感染率在感染后5 d持续上升，8 d达峰值[(79.57±3.82)%]，且明显高于C57BL/6小鼠( P<0.000 1)，感染后9 d小鼠全部死亡。C57BL/6小鼠红细胞感染率在14 d达峰值[(48.19±3.19)%]后逐渐降至0(26 d)，两组生存率差异有统计学意义( P<0.000 1)。流式结果显示，与BALB/c小鼠相比，C57BL/6小鼠脾脏和肝脏CD8 ＋T细胞绝对值数量显著增加( P<0.05)，脾脏和淋巴结CD8 ＋T EFF和CD8 ＋T CM细胞数量显著升高( P<0.05)。与BALB/c小鼠相比，C57BL/6小鼠脾脏和肝脏CD8 ＋T细胞表达GB、IFN-γ及趋化因子水平显著升高( P<0.05)。FTY720阻断试验显示，实验组小鼠生存率显著性下降( P<0.05)，肝脏和脾脏CD8 ＋T细胞绝对数明显下降( P<0.05)；且CD8 ＋CXCR3 ＋T细胞数量显著下调( P<0.05)。 结论:CD8 ＋T细胞通过T EFF和T CM亚群以分泌GB和IFN-γ方式介导抵抗 Py 17XL感染。趋化因子受体CXCR3在介导CD8 ＋T细胞向脾脏和肝脏趋化中发挥重要作用。

目的:探讨巨噬细胞来源外泌体对白念珠菌（CA）形态转换的影响及其作用机制。方法:体外培养人急性单核细胞白血病细胞系THP-1，采用佛波酯诱导其分化成M0巨噬细胞。活化CA并配置其菌悬液，感染M0巨噬细胞，并于高内涵成像分析系统下观察细胞吞噬现象。采用差速离心法分别提取M0巨噬细胞来源的外泌体（外泌体组）及CA感染M0巨噬细胞后分泌的外泌体（CA外泌体组），并通过透射电镜观察、纳米颗粒跟踪分析、Western印迹法检测外泌体表面标志蛋白来鉴定并比较两组外泌体。将这两组外泌体分别与CA共培养（外泌体处理组、CA外泌体处理组），CA独立培养作为空白对照组，倒置显微镜下观察上述3组CA的形态变化，酶联免疫吸附试验检测胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量，实时荧光定量PCR检测cAMP相关基因RAS1及CDC35（也称Cyr1）的表达水平。结果:Western印迹检测显示，外泌体组和CA外泌体组外泌体均表达外泌体标志物肿瘤易感基因101蛋白（TSG101），均不表达阴性标志蛋白钙联蛋白（calnexin）；透射电镜观察及纳米颗粒跟踪分析显示，两组外泌体形态、大小无明显差异。倒置显微镜观察显示，与空白对照组相比，外泌体处理组及CA外泌体处理组CA由酵母相向菌丝相的转换明显受到抑制，其菌丝长度也明显缩短。酶联免疫吸附试验结果显示，外泌体处理组及CA外泌体处理组CA细胞内cAMP含量[分别为（16.70 ± 0.84）和（16.82 ± 0.87）pmol/ml]均显著低于空白对照组[（21.82 ± 1.08）pmol/ml； t = 6.45、6.23，均 P = 0.003]。实时荧光定量PCR结果显示，外泌体处理组及CA外泌体处理组CA cAMP相关基因RAS1及CDC35表达均较空白对照组下调（均 P < 0.01），且CA外泌体处理组RAS1 mRNA表达量低于外泌体处理组（ t = 7.43， P = 0.002）。 结论:M0巨噬细胞外泌体以及M0巨噬细胞感染CA后外泌体均能有效抑制CA菌丝的生长，且后者抑制作用更强，其作用机制可能是通过下调cAMP/蛋白激酶A通路中的cAMP实现。

目的:观察替诺福韦酯（TDF）抗病毒治疗对HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8 +T细胞功能的影响，评估其与HBeAg血清学阴转的相关性。 方法:纳入2016年10月至2018年7月就诊的HLA-A02限制性HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者63例，予以TDF（300 mg/d）抗病毒治疗，分选基线和治疗48周时外周血CD8 +T细胞，流式细胞术检测外周血T细胞计数，酶联免疫斑点试验检测分泌穿孔素、颗粒酶B和γ干扰素（IFN-γ）的HBV特异性CD8 +T细胞频数，建立HBV特异性CD8 +T细胞与HepG2.2.15细胞直接接触和间接接触共培养系统，检测培养上清液中HBV DNA，通过检测乳酸脱氢酶水平计算靶细胞死亡率，酶联免疫吸附试验检测细胞因子表达，评估病毒特异性CD8 +T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能。2组计量资料比较采用 t检验或配对 t检验。 结果:TDF治疗48周时病毒学应答率为100%，生化学应答率为90.48%（57/63），HBeAg阴转率为25.40%（16/63）。外周血T细胞计数在TDF治疗48周时与基线及对照组比较差异均无统计学意义（ P > 0.05）。TDF治疗48周时，CHB患者分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的HBV特异性CD8 +T细胞频数较基线显著升高（ P < 0.001），HBeAg阴转的CHB患者病毒特异性CD8 +T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ的频数亦显著高于HBeAg未阴转的患者（ P < 0.05）。在直接接触和间接接触培养系统中，TDF治疗48周时HBV特异性CD8 +T细胞均可诱导HepG2.2.15细胞培养上清液中HBV DNA显著下降（ P < 0.001），分泌IFN-γ和白细胞介素-2的水平显著升高（ P < 0.05），但仅在直接接触共培养系统中病毒特异性CD8 +T细胞诱导HepG2.2.15细胞死亡的比例升高（21.7%±6.18%比16.1%±4.15%， P < 0.001）。HBeAg阴转的CHB患者HBV特异性CD8 +T细胞较HBeAg未阴转患者诱导HBV DNA下降水平更显著（ P < 0.001）、IFN-γ分泌水平升高（ P < 0.05），但靶细胞死亡比例在HBeAg阴转和未阴转患者之间的差异无统计学意义（ P > 0.05）。 结论:TDF治疗过程中，伴随病毒载量下降，病毒特异性CD8 +T细胞的细胞杀伤和非细胞杀伤功能均显著增强，且与HBeAg阴转密切相关。