目的:构建雌激素受体α配体结合域(ERα-LBD)表达载体，优化表达条件得到可溶性ERα-LBD蛋白。方法:在Addgene网站检索关键词ESR(雌激素受体，estrogen receptor)，选择符合条件的质粒载体pcDNA-HA-ER WT(Addgene plasmid # 49498; http：//n2t.net/addgene：49498; RRID：Addgene_49498)，设计引物并扩增得到目的片段ERα-LBD，分别构建蛋白表达载体pET-28a-LBD和pGEX-4T1-LBD，改变诱导温度、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度以及诱导时间对表达条件优化。待细菌裂解并提取蛋白后进行凝胶电泳，可在细菌上清的泳道中观察到明显的紫色蛋白表达条带，即为可溶性ERα-LBD蛋白。结果:pET-28a-LBD重组质粒未能表达重组蛋白ERα-LBD，重组质粒pGEX-4T1-LBD在Rosetta和BL21(DE3)感受态中以1 mmol/L IPTG诱导仅能得到包涵体；以0.2 mmol/L IPTG 16 ℃过夜诱导培养，则可得到可溶性ERα-LBD蛋白。结论:成功构建ERα-LBD表达载体并优化诱导表达条件，获得可溶性ERα-LBD蛋白。

目的:对影响冷冻D3卵裂期胚胎解冻后行过夜培养移植活产结局的相关因素进行分析，根据其中的独立因素，建立预测冷冻D3胚胎解冻后行过夜培养移植的活产概率的列线图模型。方法:回顾性分析2017年1月至2020年7月郑州大学第一附属医院5 456例接受冻融D3卵裂期胚胎移植患者的临床资料。按7∶3的比例将患者分为建模组和验证组：建模组3 831例，年龄（33±6）岁，用于构建列线图，通过多因素logistic回归分析评价患者活产结局的风险因素，根据回归系数绘制相应的列线图预测模型；验证组1 625例，年龄（33±6）岁，用于检验和校准模型的性能。结果:多因素logistic回归分析结果显示，与冷冻D3卵裂期胚胎解冻后行过夜培养移植的活产结局相关的风险因素包括：女方年龄（ OR=0.901，95% CI：0.889~0.914， P<0.001）、体质指数（BMI）（ OR=0.979，95% CI：0.957~1.002， P=0.072）、移植日子宫内膜厚度（ OR=1.121，95% CI：1.080~1.164， P<0.001）、移植胚胎数目（ OR=2.192，95% CI：1.867~2.579， P<0.001）、过夜培养后胚胎恢复分裂情况（ OR=1.405，95% CI：1.213~1.627， P<0.001）。建立的列线图模型在建模组中的曲线下面积（AUC）为0.716，在验证组中的AUC为0.739，两组校准曲线与理想曲线拟合均较好，具有良好的预测能力。 结论:女方年龄、BMI、移植日子宫内膜厚度、移植胚胎数目、过夜培养后胚胎恢复分裂是冷冻胚胎解冻后过夜培养移植活产结局的风险因素，根据上述风险因素建立的列线图有助于预测冻融D3卵裂期胚胎移植术后活产的概率。

目的:探索烧伤患者耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌（CRKP）的质粒携带情况，分析这些质粒与CRKP传播的相关性。方法:采用回顾性观察性研究方法。取从陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院2017年1—12月收治的22例烧伤患者［男20例、女2例，年龄（42±16）岁］临床相关标本中分离保存的26株CRKP，对其进行编号。采用碱裂解法提取菌株质粒，用核酸浓度检测仪测定浓度后行琼脂糖凝胶电泳观察条带情况，并对质粒行大致分型。从各个质粒分型中选取最小编号CRKP携带质粒转化感受态大肠埃希菌TOP10菌株（以下简称TOP10菌株），观察各转化菌株与TOP10菌株涂布含氨苄西林的固体LB培养基并过夜培养后生长情况，计算成功转化比例。取成功转化TOP10菌株的最小编号CRKP携带质粒的转化菌株（以下简称最小成功转化菌株）与相应编号CRKP，提取菌株携带质粒，行琼脂糖凝胶电泳观察条带情况。取前述各成功转化菌株与TOP10菌株，采用药物敏感试验检测菌株对17种临床常用抗生素的耐药性。取最小成功转化菌株携带质粒，使用第二代测序技术进行基因测序，并完成蛋白质编码基因预测、序列比对等生物信息分析，后续根据耐药基因携带情况命名为pKP03-NDM1。根据最小成功转化菌株携带质粒全基因组序列，采用PCR法及琼脂糖凝胶电泳与基因测序检测剩余25株CRKP携带质粒的新德里金属β-内酰胺酶-1（ blaNDM-1）基因携带情况，结合文献分析26株CRKP多位点序列分型中的ST分型。 结果:从26株CRKP中均提取到质粒，质粒质量浓度为19.3~189.8 ng/μL。26株CRKP携带质粒的琼脂糖凝胶电泳均可见2 500 bp以上条带，可大致分为A、B、C、D、E、F型6个型别。过夜培养后，在含氨苄西林的固体LB培养基上，未见A、B、D、E型CRKP携带质粒转化TOP10菌株或单纯TOP10菌株菌落生长，可见3号CRKP携带的C型质粒和15号CRKP携带的F型质粒转化TOP10菌株大量菌落生长（转化菌株被分别命名为TOP10-pKP03、TOP10-pKP15），成功转化比例为1/3。TOP10-pKP03携带质粒琼脂糖凝胶电泳图仅表现为1个条带，大小与3号CRKP携带质粒最大的条带一致。TOP10菌株对所检测的17种临床常用抗生素全敏感；TOP10-pKP03和TOP10-pKP15对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素耐药，对单环β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素以及替加环素敏感。TOP10-pKP03携带质粒全长为41 190 bp，该质粒携带 blaNDM-1、 bleMBL、 T4SS、博来霉素抗性基因且包含接合转移元件、松弛酶等片段，与从大肠埃希菌JN24中提取的质粒pJN24NDM1长度相同且核苷酸相似性为99%。从16株（61.5%）CRKP携带质粒中检测到了 blaNDM-1基因，该16株CRKP的ST型别中，ST11型11株，ST215型、ST260型、ST395型、ST2230型、新ST型各1株；不携带 blaNDM-1基因的10株CRKP的ST型别中，ST11型8株，ST395型、ST2230型各1株。 结论:自烧伤患者CRKP中分离测序了一个高携带率的包含 blaNDM-1基因的质粒pKP03-NDM1，该质粒可能通过介导 blaNDM-1基因在CRKP间以及CRKP和大肠埃希菌间的水平转移，导致耐药性传播。

长奈瑟菌（ Neisseria elongata）是人体口咽部正常的菌群，是一种条件致病的革兰阴性球杆菌，罕见其致病性的报道，国内报道在少数情况下可以导致败血症、骨髓炎和感染性心内膜炎，国内外有少量其他奈瑟菌属导致腹膜炎的报道。该文报道长奈瑟菌致腹膜炎1例并文献复习，该患者初始使用头孢他啶联合头孢唑林每晚留腹过夜治疗3 d，效果欠佳，后续腹膜透析液培养结果提示长奈瑟菌，结合药敏试验更换为左氧氟沙星治疗后治愈出院，希望引起临床工作者对奈瑟菌致病性的重视。

目的:利用流式细胞技术建立一种检测胰岛β细胞去分化状态的方法。方法:实验研究。常规培养胰岛Min6（小鼠β细胞系）、αTC1-6（小鼠α细胞系）、HepG2（人肝癌细胞）和F9细胞（小鼠畸胎瘤细胞）。白细胞介素1β（IL-1β）合并肿瘤坏死因子α（TNFα）或棕榈酸（PA）过夜处理Min6细胞制备β细胞去分化模型。细胞染色采用抗-嗜铬粒蛋白A（ChgA）、抗-胰岛素（Ins）、抗-胰高血糖素（Gcg）、抗-SRY盒转录因子9（Sox9）和抗-八聚体结合转录因子4（Oct4）抗体进行，流式细胞技术鉴定细胞蛋白表达情况。统计学方法采用独立样本 t检验。 结果:流式细胞实验结果显示Min6细胞高度表达Ins和ChgA，αTC1-6细胞高度表达Gcg，HepG2细胞高度表达Sox9，F9细胞高度表达Oct4，阳性率在90%左右。炎性因子（IL-1β+TNFα）处理Min6细胞导致Ins染色阳性细胞数量明显降低（92.775%±1.702%比97.125%±0.246%， P=0.045），Sox9染色阳性细胞增加（41.675%±0.390%比25.875%±3.348%， P=0.003），但ChgA和Oct4染色无明显变化（ P值均>0.05）。PA处理Min6细胞后，Gcg染色阳性细胞数量上升（54.500%±3.597%比41.160%±3.007%， P=0.022）。实时荧光定量PCR检测mRNA结果与流式细胞仪检测结果的趋势一致。 结论:利用流式细胞技术可检测各去分化模型中不同标志蛋白的表达情况，为判断胰岛β细胞的去分化状态提供了新的手段。

目的:探讨腹腔镜同期双侧肾上腺切除术(BA)治疗甲状腺髓样癌(MTC)致异位促肾上腺皮质激素综合征(EAS)的安全性和疗效。方法:患者男，56岁，2023年10月5日因MTC术后15个月，全身乏力7个月入院。既往因MTC行两次甲状腺开放手术。病理诊断：甲状腺髓样癌合并上纵隔、纵隔等处淋巴结转移，CRH(－)、ACTH(胞质弱＋)。患者术后出现糖尿病、高血压、低钾血症。入院查体：血压200/95 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，体质量61.5 kg，身高160 cm，体质量指数24.02 kg/cm 2，腰围83 cm，多血质外貌，皮肤变薄。实验室检查：血钾2.71 mmol/L，血钙1.47 mmol/L，甲状旁腺素6.0 pg/ml，空腹血糖10.51 mmol/L，糖化血红蛋白8.2%，血降钙素>2 000 pg/ml，癌胚抗原70.8μg/L。内分泌激素检查：8∶00、16∶00、24∶00时血浆ACTH分别为189.0、125.0、65.0 pg/ml；8∶00、16∶20、24∶00时血清皮质醇分别为429.30、408.14、446.61μg/L；24 h尿游离皮质醇1 200μg/24 h；1mg过夜地塞米松抑制试验后8∶00时ACTH 183.0 pg/ml、皮质醇538.27μg/L；非卧位2h醛固酮8.2 pg/ml；血、尿儿茶酚胺和甲状腺功能均未见明显异常。 18F-FDG-PET/CT检查示颈部等多发淋巴结转移。腹部CT检查示双侧肾上腺增生。垂体增强MR检查示垂体变薄。肺CT、痰培养检查示双肺散在多发感染。经全院多学科讨论，诊断为EAS、MTC术后转移、糖尿病、高血压病、低钾血症、肺部感染、轻度贫血、肝功能不全、甲状旁腺功能减退症、低钙血症。全麻下行经腹腔入路腹腔镜BA。术中先切除左侧肾上腺，翻转体位，再切除右侧肾上腺。 结果:本例手术顺利。手术时间约60 min。术中出血量约20 ml。围术期未发生并发症。病理检查：(双侧)肾上腺皮质结节性增生；(双侧)肾上腺髓质增生，ACTH(－)。术后随访3个月，血降钙素仍>2 000 pg/ml。术后1周，以及1、3个月血ACTH分别为183.0、220.0、731.0 pg/ml。但高血压、糖尿病、低钾血症等均迅速缓解。术后1个月血压100/80 mmHg，空腹血糖4.4 mmol/L，血钾3.87 mmol/L；肺部感染好转。未发生肾上腺危像。糖皮质激素替代治疗方案：氢化可的松晨起20 mg、午后10 mg。甲状腺激素替代治疗方案：左甲状腺素100μg每日1次。基因检测示Ret基因杂合突变，患者应用Ret抑制剂临床试验性治疗。结论:对于无法根治的MTC转移病灶导致的EAS，采取腹腔镜同期BA是安全、有效的，可纠正高血压、糖尿病和低钾血症，增加了MTC的治疗机会。

目的:通过反向遗传学方法，探索白念珠菌F1Fo-ATP合酶α亚基编码基因（ATP1）通过清除细胞内活性氧以逃逸巨噬细胞杀伤的生理作用。方法:以白念珠菌ATP1缺失株及其亲本株为研究对象，接种平板培养后计算菌落数评估其体外细胞活性，通过尾静脉接种小鼠后计算肾脏组织形成菌落数评估体内细胞活性。将培养过夜的白念珠菌菌液与巨噬细胞共培养后，接种平板，计算菌落数，测定菌的存活率，通过乳酸脱氢酶释放法测定巨噬细胞乳酸脱氢酶水平；以过氧化氢建立模拟巨噬细胞内氧化应激模型，过氧化氢作用白念珠菌后，通过计算菌落数比较各菌株细胞活性，采用DCFH-DA染色测定细胞内活性氧水平，实时荧光定量PCR检测过氧化氢酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平。采用双因素方差分析或Student t检验对数据进行统计学分析。 结果:在体外，亲本株组和ATP1缺失组菌落数随培养时间逐渐增多，24 h后ATP1缺失组菌落数仅为亲本株组的10%，差异有统计学意义（ F = 481.84， P < 0.001）。在小鼠体内，亲本株组肾脏组织形成菌落数随时间逐渐增多，但是ATP1缺失组逐渐减少，两组差异有统计学意义（ F = 78.27， P = 0.001）。与体内实验结果一致，体外白念珠菌菌体与巨噬细胞共培养后，ATP1缺失组白念珠菌存活率（62.67 ± 3.51）%比亲本株组（82.33 ± 2.52）%显著降低（ t = 7.88， P = 0.001），与ATP1缺失组共培养的巨噬细胞乳酸脱氢酶释放百分比（27.80 ± 3.54）%比与亲本株组共培养的巨噬细胞（87.78 ± 0.17）%显著降低（ t = 33.89， P < 0.001）。在模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞活性比亲本株组显著降低，差异有统计学意义（ F = 3 440.65， P < 0.001）。在与巨噬细胞共培养以及模仿的巨噬细胞内氧化应激模型中，ATP1缺失组细胞内活性氧水平均比亲本株组显著增高，差异有统计学意义（均 P < 0.001）。ATP1缺失组CAT1、SOD4、SOD5 mRNA水平均比亲本株组降低，差异均有统计学意义（均 P < 0.001）。 结论:ATP1缺失可能分别通过下调氧化应激和活性氧清除相关基因表达，使白念珠菌抵抗氧化应激和清除活性氧的能力明显减弱，最终不能逃逸巨噬细胞杀灭而被宿主清除。

目的:探讨微小RNA（miR）-23a是否通过靶向10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源（PTEN）基因抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路诱导的心肌细胞肥大。方法:将大鼠心肌细胞株H9c2细胞置于DMEM高糖培养基中，于37 ℃ 5% CO 2培养箱中培养，作为正常组。稳定培养48 h后，采用10 nmol/L血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激H9c2细胞构建细胞肥大模型，为AngⅡ组。将H9c2细胞接种于培养板中，置于37 ℃培养箱中培养，待细胞生长汇合度约70%时，使用不同试剂转染细胞，转染24 h后以10 nmol/L AngⅡ干预细胞。其中，转染miR-23a抑制剂的细胞为AngⅡ+anti-miR组，转染miR-23a抑制剂阴性对照者为AngⅡ+NC组，共转染miR-23a抑制剂和PTEN小干扰RNA（siRNA）者为AngⅡ+anti-miR+si-PTEN组，共转染miR-23a抑制剂和PTEN siRNA阴性对照者为Ang Ⅱ+anti-miR+si-NC组。采用Image J软件测定单细胞表面积，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中心肌肥厚标志基因α-肌动蛋白1（ACTA1）和β-肌球蛋白重链（β-MHC）基因mRNA和miR-23a的表达水平，Western blot检测细胞中PTEN蛋白和AMPK信号通路相关蛋白表达水平。为验证miR-23a是否靶向作用于PTEN基因，进行双荧光素酶报告基因实验。构建野生型pGL-WT-PTEN和突变型pGL-MUT-PTEN的荧光素酶报告基因载体重组质粒，测序正常后备用。H9c2细胞接种到24孔细胞培养板中，置37 ℃培养箱培养过夜，将miR-23a模拟物或miR-23a模拟物阴性对照与野生型或突变型报告基因重组质粒共转染细胞。转染48 h后测定萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，以二者比值作为相对荧光素酶活性。 结果:AngⅡ组的细胞表面积、ACTA1和β-MHC mRNA及miR-23a的表达水平明显高于正常组，而PTEN及p-AMPK蛋白表达水平明显低于正常组（ P均<0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-23a模拟物与野生型报告基因重组质粒共转染细胞的相对荧光素酶活性比miR-23a模拟物阴性对照共转染者低（ P<0.05），PTEN是miR-23a的靶基因。与AngⅡ组和AngⅡ+NC组比较，AngⅡ+anti-miR组细胞中miR-23a、ACTA1和β-MHC mRNA的表达水平更低，细胞表面积更小，PTEN和p-AMPK蛋白表达水平更高（ P均<0.05）。与AngⅡ+anti-miR组比较，AngⅡ+anti-miR+si-PTEN组细胞表面积较大，ACTA1和β-MHC mRNA的表达水平较高，PTEN和p-AMPK蛋白表达水平较低（ P均<0.05）。 结论:抑制miR-23a能够减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，其作用机制可能与miR-23a靶向PTEN抑制AMPK信号通路有关。

目的:验证首日悬浮法对于提高鼻咽癌类器官（nasopharyngeal carcinoma-patient derived organoids，NPC-PDO）构建成功率的有效性。方法:收集2022年1月至7月广西医科大学附属肿瘤医院和广西医科大学第一附属医院初诊的14例鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）患者样本，男性患者13例，女性1例，年龄（43.0±12.0）岁。取其中3例患者的肿瘤样本消化成单细胞悬液后平均分成2组，同时采用直接接种法和首日悬浮法对比NPC-PDO的构建效果；取余下11例患者样本随机采用直接接种法或首日悬浮法进行NPC-PDO的构建。通过光学显微镜对比两种方法构建的NPC-PDO直径大小和成球数量；采用3D细胞活力检测试剂盒对比细胞活力；采用台盼蓝染色计算细胞存活率；对可成功传代5代以上且经病理学检测与来源组织一致的病例数进行统计；采用活细胞工作站观察悬浮过夜状态下细胞的动态变化情况。采用独立样本 t检验对2组计量资料进行比较，采用卡方检验对分类资料进行比较。 结果:相比于直接接种法，首日悬浮法构建的NPC-PDO直径和成球数都增加，且保持更高的细胞活性，同时，构建成功率明显提高（80.0%比16.7%，χ 2=4.41， P<0.05），差异均有统计学意义。悬浮状态下部分细胞发生聚集现象并提高了增殖能力。 结论:首日悬浮法可以在样本量较少时提高NPC-PDO的培养成功率。

目的:观察姜黄素(CUR)介导的光动力疗法(PDT)通过磷酸酰肌醇3-激酶(PI3k)/丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路对血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及其可能的作用机制。方法:分别选取大鼠胸主动脉平滑肌细胞系(A7R5)和小鼠主动脉平滑肌细胞系(MOVAS)进行平行实验，选择20 μg/L的PDGF-BB诱导VSMCs增殖。将培养好的VSMCs分为对照组、PDGF-BB组、姜黄素组、光动力组，其中光动力组再根据照射剂量的不同，又分为低剂量光动力组(照射60 s)、中剂量光动力组(照射120 s)、高剂量光动力组(照射180 s)，共3个亚组。对照组不予任何刺激，PDGF-BB组饥饿过夜后加入含20 μg/L的PDGF-BB的新鲜培养基刺激24 h，姜黄素组先给予与PDGF-BB组相同的干预，然后换液加入含20 μmol/L CUR的新鲜培养基刺激6 h，光动力组先给予与姜黄素组相同的干预，再换液后采用425 nm激光对光动力组各亚组进行对应时长的激光照射。采用细胞活力检测法(CCK8)检测光动力组中不同激光剂量照射后，VSMCs的存活率；然后采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EDU)阳性标记率法检测4组细胞的增殖活性，采用流式细胞术对4组细胞进行细胞周期检测，采用Western blot法检测PI3K/AKT通路相关磷酸化蛋白和细胞增殖核蛋白(PCNA)的表达水平。结果:经CCK8法检测，本研究选择120 s作为激光照射的最佳剂量。干预后，中、高剂量光动力组的细胞存活率与PDGF-BB组比较，差异均有统计学意义( P<0.01)。光动力组增殖的阳性细胞比例显著低于PDGF-BB组，差异有统计学意义( P<0.05)。光动力组细胞在G0/G1期的比例明显低于对照组( P<0.01)，而在G2/M期的比例则明显高于对照组和PDGF-BB组( P<0.01)。光动力组增殖细胞核抗原(PCNA)、PI3K/AKT通路磷酸化蛋白的表达较PDGF-BB组显著下降，差异均有统计学意义( P<0.01)。 结论:CUR介导的PDT可抑制PDGF-BB诱导下的血管平滑肌细胞的增殖，其机制可能与CUR介导的PDT可下调PI3K/AKT通路相关磷酸化蛋白表达水平有关。