新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是禽类最重要的疫病病原之一,其中基因Ⅵ型NDV在鸽群广泛流行,给养鸽业造成了严重的经济损失.为深入了解基因Ⅵ型NDV在世界不同地理区域和宿主间的传播动态,本研究通过病毒分离鉴定、高通量测序、完整F基因系统发育树构建和贝叶斯系统动力学等方法进行综合分析,结果获得4株广西NDV分离株,均为基因Ⅵ型.进一步的时空分析显示,基因Ⅵ型NDV最近的共同祖先时间为1972年(95％置信区间:1965～1978),估计进化速率为1.43×10-3 substitution/site/year(95％置信区间:1.27×10-3～1.59×10-3);意大利是欧洲基因Ⅵ型NDV早期的外溢传播中心,该病毒从欧洲传播至我国,随后华东和华南成为我国的主要传播中心;病毒存在从鸽(Columba livia)到野鸟和鸡(Gallus gallus)、从野鸟到鹌鹑(Coturnix coturnix)等的跨物种传播,但病毒传播最重要的宿主是鸽.分析结果表明基因Ⅵ型NDV正快速进化,有作为突变库的潜在威胁.基于"One Health"理念,应在全球范围内加强主动监测,改善家禽管理策略,避免不同家禽之间及不同家禽与野鸟之间的直接和间接接触.这些信息有助于了解基因Ⅵ型NDV的起源、传播与进化,为制定相应防控策略提供科学依据.

目的:分离培养WU多瘤病毒(WU polyomavirus，WUPyV)并分析全基因组系统进化、同源性及种群动态特征。方法:采用实时荧光定量PCR检测2020—2022年间北京友谊医院呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物样本，利用气液两相的原代人呼吸道上皮细胞模型对WUPyV阳性样本进行病毒分离培养，Sanger测序获得全基因组，结合GenBank数据库中已公布的全基因组信息进行系统发育和进化动力学研究。结果:WUPyV在2020—2022年的检出率为4.7%(31/659)，并成功分离1株Ⅲc型WUPyV临床病毒株BJ0593。WUPyV全基因组及各基因片段同源性较高，VP2基因的平均进化速率约为每年1.256×10 －4个氨基酸替换/位点，种群动态在近十年内趋于平缓。 结论:本研究首次成功分离Ⅲ型WUPyV临床病毒株，为WUPyV的分子进化及致病性研究提供基础。

目的:研究体内微进化对阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型及耐药性的影响。方法:阿萨希毛孢子菌标准株源自荷兰真菌多态性保藏中心，阿萨希毛孢子菌原代株TO（氟康唑敏感）为解放军总医院第七医学中心皮肤科1例毛孢子菌病的临床分离株，进化株TEVO（氟康唑耐药）在该患者2014年复诊时分离。体外构建上述菌株的生物膜，使用四甲基氮盐（XTT）还原法及激光共聚焦扫描显微镜评估生物膜生长动力学并测定生物膜厚度；体外测定氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑对不同生长阶段生物膜的最低抑菌浓度（SMIC），评估生物膜的耐药性。多组间比较采用单因素方差分析，Hartley检验对数据进行方差同质性检验，若方差齐，选用LSD检验进行组间多重比较，若方差不齐，选用Tamhane′ T2检验进行组间多重比较。 结果:在阿萨希毛孢子菌生物膜黏附（0 h）及形成阶段（4 ~ 24 h），进化株TEVO代谢活性最弱（ F黏附 = 35.705， P < 0.001； F形成 = 15.042， P < 0.001）。而黏附后第48小时生物膜成熟，此时生物膜代谢活性最弱的菌株为TO株（ F = 10.985， P < 0.001）。生物膜厚度测量结果显示，成熟阶段TEVO株生物膜厚度[（26.1 ± 1.18）μm]大于TO株[（22.8 ± 1.73）μm， P = 0.001]，但小于标准株[（29.5 ± 1.28）μm， P = 0.001]。药物敏感性实验结果显示，在阿萨希毛孢子菌生物膜黏附及形成阶段，唑类抗真菌药物对TEVO株的SMIC值大于TO株；生物膜成熟阶段，3株菌生物膜的SMIC值均大于1 024 mg/L。 结论:在宿主内环境和抗真菌药物的双重压力下，阿萨希毛孢子菌生物膜相关表型发生了适应性改变，并增强了对唑类抗真菌药物的耐药性。

测序技术的快速发展导致病原体基因数据急剧增加，将这些数据与系统发育分析方法相结合，可用于阐述病原体的起源和进化、流行过程中的时空分布、参数变化以及抗原、毒力、耐药性等表型特征变化规律、病原体传播趋势预测等。本文简述了系统发育研究的目的和系统发育树的构建方法，阐述了距离法、最大简约法、最大似然法、贝叶斯法等常用系统发育重建方法的优缺点和适用范围，并重点回顾了系统动力学和系统地理学方法在国内外研究中的应用及主要流行病学参数的估计方法，通过综述也发现，病毒基因组数据建立的带有时间和地点注释的系统发育树越来越多地用于传染病疫情暴发调查和常规监测。

目的:2016年冬季出现了一种重组型GII.2[P16]诺如病毒（norovirus，NoV），并造成了我国急性胃肠炎大规模暴发，本研究旨在探究2016—2017年该病毒在我国的进化动力学和时空传播模式。方法:利用MEGA 7.0和BEAST等软件对先前获得的暴发标本中GII.2[P16] NoV全基因组、主要结构蛋白（viral protein 1，VP1）和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）基因全编码区序列进行分析。结果:序列分析显示此次重组型病毒VP1相比于RdRp基因的进化速度更快，在暴发中期，VP1蛋白的第256位出现了特异性氨基酸突变，即Val256Ile突变，且该突变位点形成的新型变异株在暴发后期成为优势流行株。基于该毒株P二聚体晶体结构的分析，发现该病毒VP1蛋白中第256位残基位点可能参与了B细胞抗原表位的组成，提示Val256Ile突变可能导致了新型变异株的抗原性发生改变，这可能是该病毒在暴发后期优势流行的原因之一，但需要进一步血清学实验的验证。基于贝叶斯地理推演结果显示，广东省可能为我国此次病毒流行的起源地，对该病毒在我国的暴发流行起了重要的作用。结论:鉴于出现功能性改变的GII.2[P16]新型变异株和广东省为我国该型病毒的暴发中心，提示有必要在珠江三角洲地区对GII.2[P16] NoV开展持续的监测和研究。

目的:了解新冠病毒感染者病毒RNA脱落时间与病毒单核苷酸突变和感染者人口、基础疾病等因素的关系，为新冠病毒感染动力学的研究提供更多线索。方法:收集江苏省2021年7月至9月暴发的一起新冠肺炎聚集性疫情感染者流行病学、临床表现、基础疾病等资料，采集病例鼻咽拭子样本，采用二代测序技术对样本进行病毒全基因组测序。利用在线分析平台判断病毒型别、分析突变位点，利用Cox比例风险模型分析新冠病毒RNA脱落时间与各研究因素的关系。结果:本起新冠疫情最终获得病毒全基因组序列的人员350例，其中女性占60.3%，年龄中位数49岁[四分位数间距( IQR，37~65岁)]，中位病毒RNA脱落时间33天( IQR，26~44天)。全基因组测序分析显示，同武汉参考株序列相比，感染者序列存在34~41个核苷酸突变位点，属于VOC/Delta变异株(B.1.617.2进化分支)，C346T、C1060T、T2803C、T7513C、A29681C为本起疫情350例病例新冠病毒基因组序列主要单核苷酸变异位点(SNP)。单因素Cox回归分析显示，年龄、基础疾病、临床分型、疫苗接种情况、SNP T2803C和T7513C对新冠病毒RNA的脱落时间存在影响；调整后的多因素Cox回归结果显示，年龄[ HR＝0.73，95% CI(0.55，0.95)]及T7513C[ HR＝0.37，95% CI(0.18，0.77)]仍然是新冠病毒RNA脱落时间延长的危险因素。 结论:本研究从病例个体因素和病毒单核苷酸变异两个角度分析了对病毒RNA脱落时间的影响，发现年长、患有高血压、较重临床症状、未接种或未全程接种疫苗，感染病毒存在T7513C突变者，存在新冠病毒RNA脱落时间较长的风险，应给予重点关注和康复后随访。

由于呼吸系统结构特殊,导致呼吸道病毒在进入过程中会经历不同的温度.呼吸道病毒对不同温度环境中的呼吸道组织细胞的感染和复制动力学会产生改变.具有不同温度嗜性的呼吸道病毒有其独特的遗传进化特点.此外,某些呼吸道病毒温度敏感的特性会降低其在呼吸系统中的大规模扩散.然而,不同温度环境中的组织细胞所产生的抗病毒免疫反应也表现出一定的差异性,这给病毒利用"低温"组织细胞作为其藏匿处提供了新途径.本文将系统介绍温度对呼吸道病毒复制动力学、子代病毒稳定性、感染性和机体固有免疫等的影响,为深入探究病毒利用温敏这一生理学特点如何促进自身更好地适应宿主机体提供参考信息.

目的 探索疑似埃可病毒病原体感染标本的分离鉴定,了解埃可病毒11型(ECHO 11)生长特性及进化特征.方法 将2021年广东省广州市发热、急性扁桃体炎患儿的咽拭子标本接种人横纹肌肉瘤细胞(RD)进行病毒分离培养通过巢式反转录聚合酶链反应及一步法聚合酶链反应等方法对疑似埃可病毒病原体进行鉴定;扩增分离株VP1基因全长序列,选择全球有代表性流行株,绘制进化树,确定分离株的基因型并研究分离株在细胞中的生长动力学.结果 从患者咽拭子标本中分离出 ECHO 11毒株,命名为Qi-2023.分离株在RD细胞中能有效增殖,病毒滴度随着复制时间的增加而上升,3～12 h之间病毒增殖最快.进化树结果表明该分离株与D型代表株聚类在一起,VP1基因核苷酸相似性为84.42％～99.08％.且与D5亚型同源性最高,VP1基因核苷酸相似性99.08％.结论 从疑似肠道病毒感染患者的咽拭子中成功分离出一株ECHO 11,为D5亚型.这些研究将为ECHO 11感染防控提供实验室数据参考.

目的 从轮状病毒阳性的牛粪便标本中,分离出一株G6P[1]型牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),对其进行培养和鉴定.方法 用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,利用MA104细胞进行分离培养;通过逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对样本VP4和VP7基因进行扩增和测序,与GenBank上的参考序列进行同源性分析,构建进化树,分析确定其G/P基因分型.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Polyacryl-amine Gel Electrophoresis,PAGE)、噬斑实验和电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)等技术对分离到的病毒进行鉴定和纯化.绘制病毒生长动力学曲线.结果 分离培养了1株BRV毒株,将其命名BLL.VP7和VP4基因测序结果显示此毒株为G6P[1]型轮状病毒.PAGE胶结果显示分离株电泳型为长型,条带呈现A组轮状病毒排列电泳图谱;通过噬斑实验将毒株进行了纯化.电镜检测到典型的轮状病毒颗粒.病毒生长动力学曲线可发现病毒在感染后6h已经开始复制.结论 本研究成功分离到G6 P[1]型牛型轮状病毒,为研究G6 P[1]型轮状病毒的病原学特征提供实验基础和技术参考.

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件.以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combi-natorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N).该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(keat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃.进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物.XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99％,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60％.通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导.