目的 构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒.方法 利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定.结果 PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒.结论 稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入.

目的:观察敲低热休克蛋白B8 （HspB8）对鼠视神经钳夹（ONC）后视网膜神经节细胞（RGC）及视网膜功能的影响。方法:构建敲低HspB8的重组腺相关病毒（AAV) 2-小发夹HspB8 （shHspB8）-绿色荧光蛋白（GFP）。雄性C57BL/6J小鼠66只随机分为正常对照组、ONC组、AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2-shHspB8组、ONC+AAV2组，分别为10、20、16、10、10只，双眼均作为实验眼。建模后3、7 d，蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜HspB8蛋白相对表达变化；GFP免疫荧光染色确定AAV2-shHspB8-GFP转染情况。建模后5 d，视动反应（OMR）、暗适应全视野闪光视网膜电图（ff-ERG）检测各组小鼠视敏度、振荡电位（OPs ）、明视负向反应（PhNR）振幅和潜伏期；视网膜铺片计数各组小鼠RGC。采用Mann-Whitney U检验、独立样本 t检验、Welch法校正 t检验、单因素方差分析、Bonferroni t检验对数据进行统计分析。 结果:与正常对照组比较，ONC3组小鼠视网膜中HspB8蛋白相对表达量明显增加，差异有统计学意义（ F=43.63， P<0.01 ）。与正常对照组比较，ONC5组小鼠视敏度明显降低，差异有统计学意义（ P<0.01）；a波、b波、OPs、PhNR振幅下降，b波潜伏期延长，差异均有统计学意义（ P<0.05）；ONC3组、ONC5组、ONC7组小鼠RGC存活率呈时间依赖性降低，差异有统计学意义（ F=384.90， P<0.01 ）。病毒转染后4周，转染率达峰值。与正常对照组相比，AAV2-shHspB8组视敏度，a波和b波、OPs、PhNR振幅、RGC计数差异均无统计学意义（ P>0.05）；ONC5+AAV2-shHspB8组RGC计数较ONC5组明显升高，差异有统计学意义（ F=10.62， P<0.01 ）。 结论:ONC诱导HspB8在视网膜中表达，导致RGC死亡并损害小鼠视功能；下调HspB8对ONC所致的RGC死亡具有保护作用。

目的:观察吞噬和运动蛋白3(ELMO3)在胰腺癌组织中的表达及与预后的关系，探讨ELMO3对胰腺癌细胞增殖及迁移侵袭能力的影响。方法:选取郑州大学附属洛阳中心医院病理科2011年3月至2019年2月存档的蜡块，免疫组织化学法测定ELMO3在49例胰腺癌及相应癌旁组织中表达，分析其与胰腺癌临床病理特征及预后间的关系。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测胰腺癌细胞株PANC-1、SW1990、BXPC-3及正常胰腺导管上皮细胞株HPDE6c-7中ELMO3 mRNA表达。胰腺癌细胞株PANC-1重组腺病毒转染ELMO3短发卡RNA(shRNA)沉默基因，RT-qPCR检测转染。细胞计数试剂盒(CCK-8)法及平板克隆实验检测PANC-1细胞增殖能力及克隆形成能力，细胞划痕试验及Transwell实验检测细胞体外迁移及侵袭能力。蛋白质印迹法(Western blot)检测PANC-1细胞株中细胞核增殖抗原(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达。采用单因素方差分析，组内比较采用LSD- t检验，组间比较采用配对或成组 χ2检验。 结果:ELMO3在胰腺癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(73.5%比26.5%， χ2＝6.773， P<0.05)，其阳性表达与胰腺癌患者性别、年龄及肿瘤部位无相关( χ性别2＝0.131， χ年龄2＝1.838， χ肿瘤部位2＝0.490， P值均>0.05)，而与胰腺癌TNM分期、分化程度及肿瘤大小明显相关( χTNM分期2＝4.410， χ分化程度2＝11.769， χ肿瘤大小2＝7.762， P值均<0.05)。ELMO3阳性表达的胰腺癌患者中位生存期(MST)明显低于阴性表达者(8.203个月比19.337个月， χ2＝10.253， P<0.05)。3种胰腺癌细胞株中ELMO3表达水平分别为21.33±0.67、17.65±0.31、16.28±0.47，均高于HPDE6c-7细胞株中的2.01±0.10( FPANC-1＝45.069， FSW1990＝22.824， FBXPC-3＝19.477， P值均<0.05)，转染后PANC-1细胞内ELMO3表达量显著下降，细胞增殖能力、克隆形成能力及迁移侵袭能力均明显下降( P值均<0.05)，且Ki-67、PCNA蛋白表达水平显著降低，而Caspase-3表达量却明显增高，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:ELMO3在胰腺癌中表达上调，其高表达提示胰腺癌患者预后不良。沉默ELMO3可抑制胰腺癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭。

目的:探讨双调蛋白（Areg）对小鼠急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的保护作用及其相关机制。方法:①动物实验：选择6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，并按随机数字表法分为3组（ n＝10）：假手术组（Sham组）、ARDS模型组〔气管内滴注脂多糖（LPS）3 mg/kg建立小鼠ARDS模型〕和ARDS+Areg干预组〔LPS制模后1 h腹腔注射重组小鼠Areg（rmAreg）5 μg〕。于LPS制模后24 h处死小鼠，苏木素-伊红（HE）染色后光镜下观察肺组织病理学改变并进行肺损伤评分；测定小鼠氧合指数、肺湿/干质量比值；用二喹啉甲酸（BCA）法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白含量，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BALF中白细胞介素（IL-1β、IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子水平。②细胞实验：获取小鼠肺泡上皮细胞株MLE12细胞，培养后分成3组：空白对照组（Control组）、LPS组（LPS 1 mg/L）和LPS+Areg组（LPS刺激后1 h加入rmAreg 50 μg/L）。于LPS刺激后24 h收集细胞及培养液，用流式细胞仪检测MLE12细胞凋亡水平；蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测MLE12细胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）活化水平以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平。 结果:①动物实验：与Sham组相比，ARDS模型组小鼠肺组织结构破坏，肺损伤评分明显升高，氧合指数明显降低，肺湿/干质量比值明显增加，BALF中蛋白及炎症因子水平明显升高。与ARDS模型组相比，ARDS+Areg干预组小鼠肺组织结构破坏减少，肺间质充血、水肿及炎症细胞浸润均明显减少，肺损伤评分明显下降（分：0.467±0.031比0.690±0.034），氧合指数明显升高〔mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）：380.00±22.36比154.00±20.74〕，肺湿/干质量比值明显下降（5.40±0.26比6.63±0.25），BALF中蛋白及炎症因子水平明显降低〔蛋白（g/L）：0.42±0.04比0.86±0.05，IL-1β（ng/L）：30.00±2.00比40.00±3.65，IL-6（ng/L）：190.00±20.30比581.30±45.76，TNF-α（ng/L）：30.00±3.65比77.00±4.16〕，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。②细胞实验：与Control组比较，LPS组MLE12细胞凋亡数量显著增多，MLE12细胞PI3K磷酸化水平、抗凋亡基因Bcl-2水平及促凋亡基因Bax水平增加。与LPS组比较，给予rmAreg处理后的LPS+Areg组MLE12细胞凋亡数量明显减少〔（17.51±2.12）%比（36.35±2.84）%〕，MLE12细胞表达PI3K/AKT磷酸化水平和Bcl-2表达水平显著增加（p-PI3K/PI3K：2.400±0.200比0.550±0.066，p-AKT/AKT：1.647±0.103比0.573±0.101，Bcl-2/GAPDH：0.773±0.061比0.343±0.071），Bax表达明显受抑制（Bax/GAPDH：0.810±0.095比2.400±0.200），差异均有统计学意义（均 P<0.01）。 结论:Areg可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制肺泡上皮细胞凋亡进而减轻ARDS。

目的:通过调控硬膜淋巴系统(DL)的功能改善小鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤，探索硬膜淋巴管作为SAH后治疗靶点的可能性。方法:实验采用C57BL/6J小鼠，通过颈内动脉刺破法诱导小鼠SAH模型。设立假手术组、SAH模型组(SAH组)以及血管内皮生长因子(VEGF)C干预组(采用重组VEGF-C胶体干预后，再进行SAH模型的诱导)。采用免疫荧光染色方法观察重组VEGF-C胶体干预10 d后DL的形态学变化，并与胶体组(仅应用胶体，不加重组VEGF-C)对比，通过伊文思蓝引流实验验证DL的功能变化情况。比较3组小鼠SAH后的皮质脑血流灌注量、脑含水量，以及神经功能损伤情况(以Garcia神经功能评分标准评估)，并通过蛋白质免疫印迹法检测各组凋亡蛋白Caspase-3的表达情况。结果:与胶体组比较，VEGF-C干预组小鼠的DL生成了更多的淋巴管分支，管腔直径也显著增大[胶体组为(24.8±4.8)μm, VEGF-C干预组为(31.2±3.9)μm， P<0.01]，同时引流至VEGF-C干预组颈深淋巴结中的伊文思蓝显色显著深于胶体组。与SAH组相比，VEGF-C干预组在SAH后早期脑损伤期的皮质血流灌注恢复更为显著，脑含水量更低[分别为(76.7±1.6)%和(81.2±1.1)%， P<0.01]，神经功能受损更轻[Garcia评分分别为(10.7±1.3)分和(14.0±0.9)分， P<0.01]；同时脑组织内凋亡蛋白caspase-3的表达水平也更低(分别为0.559±0.034和0.712±0.036， P<0.01)。 结论:通过调控DL的功能能够有效减轻小鼠SAH后的早期脑损伤。

目的:观察斯钙素2(STC2)蛋白在胃癌腹腔侵袭转移中的作用。方法:2018年6月至2019年4月利用腺病毒载体将短发夹RNA(shRNA)转染人胃癌SGC7901细胞(湖北省重点实验室提供)以沉默STC2，构建沉默STC2的SGC7901细胞株，分为实验组(STC2-shRNA组)及对照组(SGC7901组)，并用蛋白质印迹法(Western blot)验证沉默STC2效果。构建裸鼠胃癌模型：选取6～8周龄雌性裸鼠36只(购自武汉大学动物实验中心)，实验组及对照组各18只。经胃前壁大弯侧直接注射胃癌细胞SGC7901悬液接种构建鼠胃癌转移模型。接种后两组裸鼠成瘤数量、瘤体大小及重量比较采用 t检验；两组裸鼠腹腔各脏器成瘤率、抑瘤率、裸鼠生存时间、存活率、生命延长率等比较采用 χ2检验，最后Western blot检测两组胃癌肿瘤的血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、白细胞介素-10(IL-10)蛋白表达水平。 结果:Western blot实验显示，沉默STC2基因后，实验组细胞STC2蛋白量的表达较对照细胞明显减少，说明STC2沉默成功。接种8～15 d后裸鼠均有肿瘤生长，术区可触及质硬且活动不良结节。STC2-shRNA组裸鼠瘤体(0.76±0.14) mm 3、重量(1.23±0.14) g、数目(5.25±1.17)个，与SGC7901组[(3.61±0.44) mm 3、(3.98±0.21) g、(18.65±2.39)个]比较，差异有统计学意义( t＝2.364、3.022、2.523， P<0.05)。STC2-shRNA组裸鼠胃、肝脏、脾、肾、肠及肠系膜、腹膜的成瘤率依次为50.0%、33.3%、11.1%、16.7%、22.2%、5.6%，SGC7901组成瘤率依次为100.0%、100.0%、55.6%、67.7%、72.2%、67.7%，STC2-shRNA组抑瘤率达到69.1%，两组各指标比较差异有统计学意义( χ2＝5.464、5.995、7.281、5.462、9.826， P<0.05)；STC2-shRNA组组裸鼠存活时间上明显延长，30 d后裸鼠存活14只，存活率77.8%，生命延长率达到64.5%，差异有统计学意义( χ2＝6.044， P<0.05)。免疫组织化学结果显示，STC2-shRNA组VEGF-C、IL-10蛋白蛋白表达水平明显弱于胃癌细胞组，抑瘤率分别达到70.7%、71.4%。 结论:沉默STC2后的胃癌细胞SGC7901侵袭转移潜能下降，提示STC2可能有促进胃癌发生侵袭转移的作用。

目的:观察微小RNA-21(miR-21)对胰腺癌PANC1细胞侵袭、迁移和凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。方法:构建插入miR-21或靶向miR-21的小干扰RNA的重组质粒，以空质粒为对照，应用脂质体法分别转染人胰腺癌PANC1细胞，建立空白组、miR-21过表达组(过表达组)和miR-21沉默组(沉默组)PANC1细胞株，采用MTT法检测细胞增殖率，流式细胞仪检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞侵袭能力，划痕试验检测细胞迁移能力，酶联免疫法检测miR-21靶向结合的程序性细胞死亡因子4(PDCD4)蛋白的表达，蛋白质免疫印迹法检测磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)、血管内皮生长因子(VEGF)、survivin、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达。结果:培养24 h时，空白组、过表达组、沉默组细胞增殖率分别为(20.72±5.62)%、(28.46±6.12)%、(14.05±3.36)%；细胞凋亡率分别为(5.89±0.26)%、(4.62±0.19)%、(8.66±2.25)%；穿膜细胞数分别为(212.4±32.5)、(508.8±50.7)、(50.9±10.6)个/200倍视野；细胞迁移覆盖面积分别为(75.6±12.1)、(118.8±20.2)、(48.8±9.5)mm 2/200倍视野；PDCD4表达量为0.85±0.22、0.72±0.10、1.36±0.41；PTEN表达量为0.85±0.21、0.28±0.09、1.36±0.45；VEGF表达量为0.79±0.24、1.15±0.31、0.46±0.10；survivin为1.02±0.33、1.51±0.42、0.52±0.12；MMP-2为1.12±0.22、1.86±0.52、0.56±0.18；MMP-9为1.06±0.15、1.78±0.48、0.49±0.12，3组间的差异均有统计学意义( P值均<0.05)。与空白组比较，沉默组的细胞凋亡率及PDCD4、PTEN表达量均增加，而细胞增殖、侵袭、迁移能力以及VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表达量均下降；过表达组的变化与沉默组完全相反，过表达组、沉默组与空白组的差异均有统计学意义( P值均<0.05)。 结论:沉默miR-21能抑制PANC1细胞的增殖、迁移和侵袭力，促进细胞凋亡，其机制可能与上调PDCD4及PTEN蛋白表达有关。

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:探讨重组肿瘤抑素T42肽对人肝癌干细胞(LCSCs)恶性表型的影响及作用机制。方法:2018年6月至2019年6月，培养人肝癌细胞系SMMC-7721，利用免疫磁珠法富集CD133 ＋肝癌干细胞LCSCs。实验共分3组：正常组、T42肽(40 mmol/L)处理组和5-氟尿嘧啶(40 mmol/L)处理组。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)检测处理后第1、2、3、4天的细胞活力；克隆形成实验检测3组细胞处理后第14天的克隆形成情况；流式细胞术检测3组LCSCs处理24 h后的细胞凋亡率；Transwell实验分别检测3组LCSCs处理48 h后的迁移和侵袭能力；蛋白质印迹法(Western blot)检测3个不同处理组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)、剪切型含半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(Cl-Caspase-3)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9等的表达。符合正态分布的组间比较采用 t检验，不符合正态分布的采用单因素方差分析。 结果:T42肽、5-氟尿嘧啶处理组LCSCs的克隆形成率[(41.67±8.26)%、(52.03±10.35)%]、细胞迁移数[(97.17±13.73)、(111.51±8.60)个]和细胞侵袭数[(79.02±7.87)、(86.03±6.54)个]显著低于对照组[(98.67±7.37)%、(185.67±12.88)个、(139.83±18.32)个]，凋亡率[(13.21±0.38)%、(9.02±0.35)%]显著高于对照组[(4.07±0.38)%]，差异均有统计学意义( t＝12.613、8.991；11.513、11.732；7.472、6.781；41.503、23.412， P值均<0.05)。Western blot结果显示T42肽、5-氟尿嘧啶通过增加bax和Cl-Caspase-3，抑制bcl-2的蛋白表达来诱导LCSCs凋亡，通过上调E-cadherin同时下调Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达水平来调节LCSCs的迁移和侵袭。 结论:T42肽具有抑制LCSCs的增殖、迁移、侵袭，并促进其凋亡的作用。

目的:比较4种HIV抗体确证试剂盒的检测性能，为临床使用试剂提供参考。方法:使用2种免疫印迹法(Western blot, WB)试剂、2种重组/线性免疫印迹法(recombinant immunoblot assay/line immune assay，RIBA/LIA)试剂平行检测185份样本，采用McNermar检验分析试剂检测结果与HIV感染状态的一致性，以最常用MP公司的WB试剂检测结果为参照进行优势比( OR)计算。 结果:4种试剂检测结果与HIV感染结果一致率为83.24%～92.43%， Kappa值为0.558～0.831。英旻泰公司的WB试剂检测57份HIV未感染样本的 OR值为0.932(95% CI：0.446～1.946， P＝0.851)，RIBA试剂的 OR值为2.348(95% CI：1.069～5.158， P＝0.034)，LIA试剂的 OR值为23.064(95% CI：5.125～103.789， P<0.001)；LIA试剂检测128份HIV感染样本的 OR值为0.153(95% CI：0.034～0.700， P＝0.016)。对95份HIV抗体筛查阳性样本检测，LIA试剂有反应的比例最低，与其他3种试剂有反应的比例差异有统计学意义( P值均<0.05)，其他3种试剂差异无统计学意义( P值均>0.05)。出现非特异反应时条带数均≤4条，显色较浅的条带比例占52.1%(37/71)，出现条带主要为gp160(81.3%)、p24(71.9%)和p17(28.1%)。 结论:两种WB试剂检测结果无显著性差异，RIBA/LIA试剂可减少不确定结果的产生，但LIA试剂对于弱反应性样本存在假阴性风险。