目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

[目的]通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平,并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析,旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础.[方法]利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达,首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1 和Ydj1 分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用,并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析.[结果]TPRK在毕赤酵母GS115 中表达,其最适反应条件为 65℃、pH 9.0,且具有良好的热稳定性和pH稳定性.过表达ssa1、hac1、erj5 和sil1 基因的重组菌株酶活分别提升了 36.8%、20.0%、17.7%和 14.8%.5 L发酵罐进行高密度发酵,诱导 72 h后,TPRK的酶活达到 77 471.99 U/mL.在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落,起到剥鳞效果,并且最适水解条件为:TPRK添加量为 300 U/mL、反应温度 55℃、pH 9.0 和反应时间 2 h.[结论]过表达分子伴侣Ssa1 能够有效提升TPRK的表达量,利用该TPRK处理羊毛纤维,可有效去除羊毛鳞片层,而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小.

[目的]为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492 的生物学功能.[方法]对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492 主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能.[结果]几丁质酶AO-492 有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18 家族结构域,并含有糖苷水解酶 18 家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构.系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近.SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492 分子量约为 59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应.ReAO-Z492 最适温度为 40℃,最适pH为 7.0;Mg2+对其酶活有促进作用,而Ag+、Cu2+、Fe3+和Zn2+有抑制作用.ReAO-Z492 对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用.

利用异源重组表达系统表达外源蛋白是基因工程研究的重点.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲基营养型酵母,由于其易于遗传操作、高水平分泌外源蛋白、翻译后修饰等特点,已成为工业应用中蛋白质生产的重要菌株,常被用于酶制剂的生产.然而,部分外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达水平较低,仍有待提升的空间.因此,进一步探索提升毕赤酵母中外源蛋白表达量的原理和方法,将对降低毕赤酵母表达系统工业化生产成本,提高经济效益,具有重要的意义.本文主要从基因水平、转录水平、翻译水平、折叠分泌水平、抗逆水平、发酵工艺六个方面归纳总结了近年来毕赤酵母提高外源蛋白表达的优化策略的研究进展,旨在为提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达水平提供有益参考.

蜕皮是许多变态发育昆虫的一种重要生理现象,昆虫通过蜕皮液中的酶对新旧表皮进行分离.已有相关蛋白组学的研究证明,家蚕蜕皮液中具有一种含量丰富的羧肽酶 A(Bombyx mori-carboxypeptidase A,Bm-CPA),目前对其作用功能尚不清楚.为了更好地了解Bm-CPA在家蚕蜕皮发育过程的作用,本研究通过生物信息学分析、实时荧光定量 PCR、抗体制备、免疫荧光染色和毕赤酵母表达等方法对Bm-CPA进行了研究.结果显示,Bm-CPA具有保守的M14 锌羧肽酶结构域和糖基化位点,并且受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)调控,在眠期和上簇期的表皮中大量表达;免疫荧光染色显示 Bm-CPA 在眠期的表皮中富集,Bm-CPA 抑制剂会导致幼虫因无法蜕皮而死亡;通过毕赤酵母表达系统在体外成功获得大量的重组 Bm-CPA 蛋白.这些结果为深入了解家蚕蜕皮发育过程提供了一定的参考.

目的 对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考.方法 将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性.结果 目标蛋白wtRBD和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d间隔时间的IgG抗体滴度增加了 1.8倍(44 923 vs.80 507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2 191 vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了 32 255(2 167～88 084);在采用5μg或30 μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5 μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考.

为开发能高效降解游离棉酚的酶蛋白.从土壤中筛选得到一株Bacillus amyloliquefaciens XP-13,从其基因组扩增获得了基因BmLac,进而构建Ppic9k-BmLac重组质粒,将其导入毕赤酵母GS115 实现了异源表达,对漆酶BmLac的酶学特性、棉酚降解效果进行研究.结果表明,以ABTS为底物时,该酶的最适反应条件为pH 4,55℃,最适条件下酶活是 101.56 U/mL;在 90℃下孵育 1 h后,相对酶活仍保留 70%以上;在pH 3-7 孵育 1 h,其相对酶活均保留 96%以上.1 mmol/L的Cu2+能使该酶酶活提高1.93 倍,但高浓度(10 mmol/L)的Fe2+、Fe3+和Al3+完全抑制该酶活性.在 55℃下反应 2 h后,该酶对棉酚的降解率高达 94.57%(无介体)和 98.73%(有ABTS).综上,漆酶BmLac具有良好的热稳定性和广泛的pH适应性,并能有效降解棉酚,该酶为有效降解棉籽粕中的游离棉酚提供基础支撑.

从骆驼科动物血清中提取的纳米抗体,由于其具有不同于传统单克隆抗体的结构和较小的尺寸,以及高特异性、高理化稳定性和组织渗透性等特征,因此显示出巨大的应用潜力,被认为是生物医学发展中有前景的治疗性蛋白.利用微生物生产表达纳米抗体无须翻译后修饰,可实现大规模生产,且显著降低生产成本.目前常规生产纳米抗体的表达系统主要为大肠杆菌、毕赤酵母和哺乳动物细胞系,此外还有真菌、植物细胞、昆虫细胞及乳酸杆菌等表达系统.详细介绍了不同表达系统的特点、优势及应用,并总结了各个系统亟须解决的问题,同时概述了治疗性纳米抗体药物的生产、研发情况及临床疾病治疗应用,以期为选择合适的表达系统,用于治疗性纳米抗体的生产及临床治疗提供参考依据.

目前,绝大多数酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株利用菊糖生产乙醇的能力有限,而蔗糖转化酶Suc2 是酿酒酵母水解菊糖的关键酶,其分泌水平直接影响酿酒酵母转化菊糖为乙醇的性能.为提高酿酒酵母中蔗糖转化酶Suc2 的分泌表达水平,利用生物信息学的分析方法选择出 11 种不同的分泌信号肽,包括酿酒酵母内源性、其他菌株来源以及已报道序列优化改造的信号肽,将它们融合至Suc2 并构建了相应的酿酒酵母BY4741 重组菌.其中,酿酒酵母内源分泌信号肽AGA2 能使蔗糖转化酶Suc2 更有效的分泌,含有信号肽AGA2 的重组菌BY-AG的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活相对于含有天然信号肽的原始菌BY-S分别提高 42%和26%,其利用菊糖产乙醇能力较原始菌提高了32%,乙醇产量达到78.11 g/L.在使用毕赤酵母(Pichia pasto-ris)分泌信号肽MSB2 时,蔗糖转化酶Suc2 的分泌水平也有提高,含有信号肽MSB2 的重组菌BY-MS较原始菌BY-S的蔗糖酶酶活和菊糖酶酶活分别提高了80%和74%,同时,利用菊糖产乙醇能力也提高了56%,产量达到86.31 g/L.最后,对重组菌BY-MS摇瓶发酵过程中的生物量、蔗糖酶酶活、残糖总量和乙醇产量进行了监测,结果表明,重组菌BY-MS的发酵性能较原始菌BY-S有显著提高.本研究为提高蔗糖转化酶Suc2 的分泌水平、构建高效菊糖基乙醇生产菌株提供参考.

[背景]S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)作为所有生物体内的重要中间代谢物,不仅可作为膳食补充剂,还具有良好的临床应用价值.[目的]将毕赤酵母重组菌GS115/DS16的SAM消耗途径阻断,进一步提高SAM的产量.[方法]分别敲除毕赤酵母重组菌GS115/DS16的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因sah1、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2 和 L-甲硫氨酰tRNA合酶基因msm1,构建工程菌G/Dsah、G/Dspe和G/Dmsm.检测 3 个工程菌的生长和SAM产量,以及 L-Met添加量对SAM积累的影响.[结果]与出发菌GS115/DS16 相比,工程菌G/Dsah、G/Dspe和G/Dmsm的单位菌体SAM产量分别提高了 29.3%、55.6%和 24.8%,其生长无显著差异.L-Met添加量优化后(0.06%),G/Dsah 和 G/Dmsm 单位菌体的 SAM 产量分别提高了 26.4%和 28.9%.[结论]构建的毕赤酵母工程菌可用于SAM的工业化生产,该代谢工程策略可用于改进其他化学品的生产.