目的:研究嵌合腺病毒35型载体和痘苗病毒载体SIVenvT疫苗通过不同策略联合免疫小鼠所诱导的细胞和体液免疫应答。方法:通过PCR和Western blot方法对表达SIV mac239株SIVenvT基因的重组嵌合腺病毒35型(rAd5F35-SIVenvT)和重组痘苗病毒安卡拉株(rMVA-SIVenvT)进行体外鉴定。采用两种不同的策略联合免疫BALB/c小鼠，即同源载体免疫和异源载体免疫。通过ELISPOT方法检测小鼠脾脏中分泌SIV Env特异性IFN-γ的淋巴细胞数量，ELISA方法检测血清SIV gp120抗体滴度，比较两种免疫策略诱导小鼠产生细胞和体液免疫应答的差异。结果:rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT均能在HEK293细胞中有效表达SIVenvT蛋白。初次免疫后第4周，两组SIV Env特异性细胞免疫应答和SIV gp120抗体均达到峰值，随后呈波动下降趋势。异源免疫组诱导小鼠的应答水平高于同源组，其中第4周和第16周异源组细胞免疫应答强度显著高于同源组，第4周异源组SIV gp120抗体滴度显著高于同源组。结论:rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT两种载体疫苗联合免疫策略能诱导小鼠产生较强细胞和体液免疫应答。

目的:对我国非复制型痘苗病毒NTV进行基因改造，以提高其免疫原性。方法:通过基于CRISPR-Cas9技术的痘苗病毒同源重组方法，在痘苗病毒F1L基因缺失的同时回插C7L基因，构建NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L。然后将该重组病毒以10 7 PFU免疫BALB/c小鼠，采用ELISA和ELISpot方法分别检测修饰株NTV-ΔF1L-C7L诱导产生的体液免疫和细胞免疫水平，并采用噬斑减少中和实验测定中和抗体水平。 结果:经PCR和western blot鉴定证明构建的NTV修饰株NTV-ΔF1L-C7L的F1L基因缺失，同时C7L基因回插在该区域，且C7L基因能正常表达，说明重组病毒构建正确。NTV-ΔF1L-C7L免疫小鼠后，ELISA结果表明重组病毒NTV-ΔF1L-C7L诱导产生的IgG抗体水平高于NTV；ELISpot结果亦能够表明该重组病毒能够诱导产生水平更高的IFN-γ；噬斑减少中和实验结果表明，该重组病毒比NTV能够诱导产生水平更高的中和抗体。结论:正确构建了NTV基因修饰株NTV-ΔF1L-C7L，相比于NTV，其能诱导更强的体液免疫和细胞免疫，为我国天花或猴痘疫苗的换代产品研发提供参考数据。

目的:以痘苗病毒中和抗体表位D8L区为重组位点进行外源基因替换，从而降低载体自身免疫原性。方法:通过同源重组技术，插入表达流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)序列，对D8L区进行替换，构建重组痘苗病毒流感疫苗，同时以表达相同HA的TK区重组痘苗病毒疫苗为对照。Western blot对HA的表达进行验证；小鼠实验、ELISA、血凝抑制试验检测每次免疫后2周的血清抗体效价，攻毒保护试验评价重组痘苗病毒的保护效力。结果:Western blot表明构建的重组疫苗均能正确表达HA D8L蛋白。ELISA、血凝抑制试验显示，初次免疫后，D8L区突变的重组痘苗病毒疫苗HA抗体效价略高于TK区突变的重组疫苗，并随着免疫次数的增多差异有统计学意义( P<0.05)；其免疫原性显著低于TK区突变的重组疫苗( P<0.05)，随着免疫次数增加，二者差异无统计学意义( P>0.05)。H1N1pdm攻毒后保护效力评价结果显示，D8L区突变组可完全清除病毒，且小鼠肺部炎症水平更低、组织损伤更少。 结论:通过将外源基因插入到痘苗病毒载体中和抗体表位D8L区，有助于降低载体自身的免疫原性，并提高外源基因的免疫原性，为痘苗病毒载体在疫苗或基因治疗领域作为递送工具提供了参考。

目的:利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法:设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果:本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。

目的:建立一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的特异性强、灵敏度高的猴痘病毒核酸检测方法。方法:根据已知猴痘病毒基因保守区设计合成重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification, RAA)引物和成簇规律间隔的短回文重复序列RNA(clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNA，CRISPR RNA, crRNA)，利用荧光检测技术筛选特异crRNA，通过荧光计数读取CRISPR/Cas12a检测结果，同时对所建立方法的灵敏性和特异性进行评价。结果:建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法，其灵敏度为2.5拷贝/反应，且与鼠痘病毒、痘苗病毒无交叉反应，具有高特异性。结论:建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法，为高效、快速、特异性检测猴痘病毒感染提供了有力工具。

目的 探讨溶瘤病毒感染、免疫效应细胞补充及免疫检查点阻断三者联合策略在胃癌治疗中的意义.方法 以既往实验获得的痘苗病毒为基础构建的携带T淋巴细胞趋化因子CXCL9基因和白细胞介素7(IL-7)基因的重组溶瘤痘苗病毒(VV-IL7-CXCL9)干预治疗裸鼠皮下种植瘤方式建立的胃癌荷瘤动物模型.实验建立重组溶瘤痘苗病毒瘤内注射+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)+免疫检查点阻断剂(PD-1单抗)三联干预组、三种措施单独干预组、二联干预组及空白对照组.按照既定分组给药干预后采用肿瘤生长曲线法、肿瘤抑制率法及动物活体发光法检测肿瘤治疗效果并采取ELISA法检测各组动物血清及组织匀浆CXCL9和IL-7两分子浓度.结果 动物模型治疗干预结果显示重组溶瘤痘病毒+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)+免疫检查点阻断剂(PD-1单抗)三联干预组肿瘤生长明显减缓,显著慢于其他干预组及空白对照组.结论 在胃癌动物模型干预实验中采用重组溶瘤痘病毒瘤内注射+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)+免疫检查点阻断剂(PD-1单抗)三联干预的生物免疫治疗策略具有强烈的抑瘤作用.

目的 构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,并探讨其对胃癌细胞的杀伤作用及可能的机制.方法 利用同源重组的方法在痘苗病毒VG9的TK区插入锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)基因,构建重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,经筛选及纯化后,测定病毒滴度.将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及痘苗病毒VG9分别按不同的MOI(0.01、0.1、1、10)及转染时间(12、24、36、48 h)转染至人胃癌细胞株7901,MTT法检测病毒对胃癌细胞的杀伤作用.按MOI=1将重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD及VG9分别转染人胃癌细胞株7901 48 h,同时以PBS作为对照,Western blot法检测胃癌细胞中MnSOD的表达,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡情况.结果 经筛选及纯化后,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD滴度为2×108 pfu/mL.MOI为1和10时,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞的杀伤作用明显优于VG9(P＜0.05);转染24和36 h,重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD对胃癌细胞的杀伤效果明显强于VG9(P＜0.05).转染后,MnSOD蛋白可在胃癌细胞中呈高表达,且VG9-MnSOD组胃癌细胞的凋亡率明显高于VG9组及对照组(P＜0.05).结论 成功构建了重组溶瘤痘苗病毒VG9-MnSOD,其对胃癌细胞具有明显的杀伤作用,该作用可能是通过促进胃癌细胞凋亡产生的.

目的 研究人乳头状瘤病毒18型(HPV18)融合蛋白和重组痘苗病毒联合免疫诱发小鼠产生的细胞免疫和体液免疫反应水平.方法 原核表达系统表达并纯化的HPV18L231-600E7E6融合蛋白与表达HPVI8E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒(rVV18E7E6)联合免疫C57BL/6小鼠,通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)、ELISA和假病毒中和实验分别对不同免疫程序的免疫组诱发机体产生的细胞免疫和体液免疫应答进行评价.结果 HPV18L231-600E7E6融合蛋白/CpG佐剂初免、重组痘苗病毒rVV18E7E6加强免疫的联合免疫方式可以诱发小鼠产生最强水平的T细胞免疫反应,同时可产生较高水平的结合抗体,并能检测到低水平中和抗体.结论 以HPV18L231-600E7E6/CpG初免、重组痘苗病毒rVV18E7E6加强免疫的联合免疫策略诱导了较强的细胞免疫和体液免疫应答,可作为治疗HPV18型慢性感染和宫颈癌手术后辅助治疗的候选疫苗.

目的 明确新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)包膜糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)头颈部相互作用区91～112氨基酸(aa)片段的功能,阐明该区域促进细胞特异性膜融合的作用.方法 比对NDV HN 91～112 aa与MeV H、RSV G、hPIV3 HN,确定吸附蛋白相应的基因序列,采用片段缺失、置换和同源重组技术,构建NDV HN缺失突变体De(HN)和嵌合体Ch(MeV)、Ch(RSV)、Ch(hPIV3);痘苗病毒-T7瞬时表达系统在真核细胞BHK-21内表达各突变体;间接免疫荧光法和流式细胞术分析各突变体蛋白在细胞表面的表达情况;蛋白功能试验分别测定各突变体蛋白的促细胞融合活性、受体识别活性和神经氨酸酶活性.结果 De(HN)和Ch(MeV)、Ch(RSV)、Ch(hPIV3)的细胞表面表达效率分别为野生型的9.04％、82.20％、70.16％和75.65％;促细胞融合活性分别为野生型的3.83％、24.76％、29.42％和57.84％(P均＜0.05),其中De(HN)的促细胞融合活性基本消失,镜下未观察到合胞体形成;受体识别活性分别为野生型的13.48％、36.25％、34.93％和65.22％(P均＜0.05),与促细胞融合活性具有一致性;神经氨酸酶活性分别为野生型的10.81％、54.42％、50.13％和60.35％(P均＜0.05).结论 NDV HN蛋白91-112aa对膜融合功能有重要影响,缺失突变体膜融合功能的消失与其未能在细胞表面有效表达有关.

目的 对重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE进行动物安全性评价. 方法 用重组痘苗病毒rVTT-JEVE对BALB/c小鼠进行免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果;并通过检测小鼠体内rVTT-JEVE病毒残留,分析乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE的安全性. 结果 BALB/c小鼠经两次免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.4倍(t=3.704,P＜0.05),中和抗体效价是SA-14-14-2组的1.6倍(t=4.418,P＜0.05),T淋巴细胞增殖水平为SA-14-14-2组的1.7倍(t=3.092,P＜0.05).rVTT-JEVE接种小鼠后第1d各脏器均有rVTT-JEVE病毒残留,第3d颌下淋巴结已无病毒残留,第7d仅脾脏和雄性小鼠心脏有少量病毒残留,之后均无病毒残留. 结论 重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE免疫小鼠可产生较好的免疫效果及免疫安全性.