目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

目的:建立一种实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增（reverse transcription recombinase-aided amplification，RT-RAA）技术检测寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）的方法，以实现ZIKV的现场快速筛查及诊断。方法:通过基因组序列比对，选择ZIKV保守序列设计RT-RAA特异性引物和探针，并用系列稀释的ZIKV重组质粒与毒株核酸验证方法的灵敏性与重复性，通过检测登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒等其他虫媒病毒验证方法的特异性。结果:建立的RT-RAA方法可在39 ℃恒温条件下30 min内对ZIKV进行高效扩增，检测系列稀释的ZIKV重组质粒，其95%检测限可达到15拷贝/反应，特异性强，与登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒虫媒病毒无交叉反应，且重复性好。结论:本研究建立的ZIKV的RT-RAA等温扩增方法，具有反应迅速，无需精密仪器，操作简单等优点，适合于应急快速检测。

等温扩增技术是在恒温条件下进行扩增的一类新型核酸扩增技术。基于该技术建立的方法操作简便，且具有较高的灵敏度与特异性，在临床与科研等方面展现了较好的应用前景。本文就环介导等温扩增、交叉引物扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的等温扩增和滚环扩增等技术的原理、特点及应用进行了综述。

多重核酸检测技术具有可同时检测多个靶标、高通量、低成本等优势，满足大规模筛查、定量等检测需求。多重聚合酶链反应广泛应用于病原体、甲基化DNA和突变基因检测以及单核苷酸多态性分型；重组聚合酶扩增、环介导等温扩增等等温扩增技术在即时检测领域有很好的前景；基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统的多重核酸检测技术因其高灵敏度、高特异性成为新的研究热点；而宏基因测序在新发病原体突变监测和肿瘤学研究等领域发挥主导作用。本文对各种多核酸检测技术的临床应用现状及未来发展方向进行论述。

目的:建立一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的特异性强、灵敏度高的猴痘病毒核酸检测方法。方法:根据已知猴痘病毒基因保守区设计合成重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification, RAA)引物和成簇规律间隔的短回文重复序列RNA(clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNA，CRISPR RNA, crRNA)，利用荧光检测技术筛选特异crRNA，通过荧光计数读取CRISPR/Cas12a检测结果，同时对所建立方法的灵敏性和特异性进行评价。结果:建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法，其灵敏度为2.5拷贝/反应，且与鼠痘病毒、痘苗病毒无交叉反应，具有高特异性。结论:建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法，为高效、快速、特异性检测猴痘病毒感染提供了有力工具。

目的:建立一种基于反转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aid amplification, RT-RAA)联合CRISPR/Cas12a反应的人副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)核酸检测方法。方法:根据HPIV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N)基因保守区序列，设计RT-RAA所需型特异性引物及crRNA(CRISPR RNA, crRNA)，应用Cas12a切割荧光标记探针产生的荧光强度筛选高敏感性HPIV1-4型特异性crRNA并优化crRNA、Cas12a和探针浓度。利用体外转录RNA及临床样本，评价RT-RAA联合CRISPR/Cas12a检测方法的检测下限及特异性。结果:从设计的crRNA中筛选出高敏感性的HPIV1-4型特异性crRNA，并建立基于荧光强度测量的RT-RAA联合CRISPR/Cas12a的HPIV核酸检测方法，该方法对各型HPIV的检测下限均可达到10拷贝/反应。采用该方法检测8种其他呼吸道病毒感染的临床样本，均未显示有交叉反应。结论:建立的HPIV 1-4型荧光法CRISPR核酸检测方法快速、特异，且可无需专业核酸检测设备。

目前,我国正处于H7N9禽流感病毒疫情高发季节.2017年春季以来,我国福建、云南、湖南和湖北等16个省份均出现了感染H7N9的病例,并且感染数量和范围与去年同期相比有明显上升和扩大.H7N9禽流感病毒因其对人类的高致死率和快速的传播速度引起了全球的广泛关注.快速、准确和高效的检测对H7N9禽流感的疫情监测和防控至关重要.为此,该文就目前应用于H7N9禽流感病毒研究中的分子生物学诊断技术(包括聚合酶链反应、基因芯片、依赖核酸序列的的扩增、高分辨率熔解曲线、液相芯片、重组酶介导的等温扩增法、高通量测序、环介导等温扩增及多重PCR-酶联免疫吸附法等)进行了综述.

本研究通过使用逆转录酶,将基孔肯雅热病毒RNA首先逆转录为cDNA.选取基孔肯雅热病毒保守序列设计引物及探针,建立基孔肯雅热病毒重组酶介导一步法等温核酸扩增RT-RAA (Reverse transcription recombinase aided amplification, RT-RAA) 快速检测法,并分析其灵敏度及特异性.结果显示,该方法整个过程在39 ℃进行,检测时间短 ( <20 min),检测下限可达100 copy,并与黄热病毒、日本乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、登革病毒I型等蚊媒病毒不存在交叉反应.本文建立的基孔肯雅热病毒RT-RAA检测法,灵敏度高、特异性强、操作简便,适应于口岸基层基孔肯雅热病毒的快速检测.

目的 建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA).方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系.应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性.结果 建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成.以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL.建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性.结论 本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值.

目的 建立寨卡病毒一步法重组酶聚合酶等温扩增检测方法(reverse transcription recombinase aid amplification,RT-RAA),为国境口岸提供现场快速检测方法.方法 根据寨卡病毒基因组保守片段NS2a设计引物和探针,建立寨卡病毒RT-RAA检测方法.用合成的含有寨卡病毒基因序列的质粒测试方法的重复性和灵敏度,用登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒、乙脑病毒核酸测试方法的特异性.结果 寨卡病毒一步法RT-RAA检测时间短(＜20min),对寨卡病毒阳性质粒检测下限为103拷贝/μl,重复性好,与登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒、乙脑病毒无交叉反应.结论 建立的寨卡病毒一步法RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,适用于口岸现场快速检测.