目的:探讨Cre-loxP重组酶系统构建的兴奋性神经元腺苷酸活化蛋白激酶α1( AMPKα1)基因特异性敲除模型小鼠大脑能量代谢及认知功能的改变。 方法:将杂交繁育获得的16只基因型为 AMPKα1 flox/flox/Camk2a-Cre/ERT2 的6月龄小鼠按随机数字表法分为 AMPKα1敲除组( n=8)与 AMPKα1野生组( n=8)， AMPKα1敲除组小鼠每天腹腔注射0.1 mL他莫昔芬(20 mg/mL，溶于玉米油)以控制 AMPKα1基因在兴奋性神经元中的敲除， AMPKα1野生组小鼠每天腹腔注射等量玉米油以作对照。连续注射5 d，并等待7 d后分别采用Morris水迷宫和T迷宫实验检测2组小鼠的空间学习记忆及空间工作记忆能力，采用化学交换饱和转移成像(CEST)观察2组小鼠海马及海马周围皮层的葡萄糖代谢情况，采用Western blotting实验检测2组小鼠海马及海马周围皮层的AMPKα1、谷氨酸受体1(GluR1)蛋白表达情况。 结果:与 AMPKα1野生组比较， AMPKα1敲除组小鼠第3、4天的逃避潜伏期明显延长[(13.90±3.72) s vs. (22.40±6.28) s；(11.95±3.86) s vs. (22.39±9.77) s]，穿越平台次数明显减少[(5.25±1.83)次 vs. (1.75±1.28)次]，自由交替率明显降低[(73.21±9.16)% vs. (48.21±11.29)%]，海马及海马周围皮层的葡萄糖代谢水平明显降低(2.77±0.67 vs. 1.51±0.81；2.42±0.95 vs. 1.31±0.83)，海马及海马周围皮层AMPKα1、GluR1蛋白表达明显降低(AMPKα1：0.70±0.05 vs. 0.49±0.03，0.98±0.04 vs. 0.64±0.06；GluR1：1.22±0.18 vs. 0.60±0.11，0.96±0.08 vs. 0.79±0.04)，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:特异性敲除兴奋性神经元 AMPKα1基因可导致小鼠大脑葡萄糖代谢异常，从而引起其认知功能障碍，其机制可能与能量代谢障碍引起兴奋性突触障碍有关。

目的:总结亮氨酸拉链样转录调节因子1（leucine zipper like transcription regulator 1， LZTR1）基因变异所致Noonan综合征（Noonan syndrome，NS）的临床特征及遗传学特点。 方法:回顾性分析2021年1月因超声提示胎儿颈项透明层（nuchal translucency，NT）增厚及有不良孕产史来南方医科大学南方医院产前诊断中心行介入性产前诊断，家系全外显子测序（whole exome sequencing，WES）确诊为NS的家系的临床资料。以“努南综合征” “Noonan综合征”“亮氨酸拉链样转录调节因子1”“Noonan syndrome”及“ LZTR1”为关键词，检索PubMed、Web of Science、中华医学期刊全文数据库、中国知网数据库及万方数据知识服务平台自2013年1月至2022年10月收录的文献。总结和分析国内外报道的 LZTR1基因变异所致NS病例的临床表现及遗传学特点。对数据资料采用描述性分析。 结果:（1）病例资料：该家系WES并经Sanger测序验证发现家系先证者（Ⅱ-2）及胎儿（Ⅱ-3）均存在 LZTR1基因c.842C>T及c.2248G>A复合杂合变异，分别来自于父母。结合出生后先证者存在NS典型的特殊面容及身材矮小表型，诊断胎儿及先证者为常染色体隐性遗传NS患儿。孕妇因胎儿全身严重水肿，于妊娠22周终止妊娠。先证者就诊时3岁，存在NS典型的颅面部特征及身材矮小，后于外院儿科进行定期随访，应用重组人生长激素改善身高。4岁上幼儿园，可与小朋友正常交流及游戏。（2）文献回顾：检索并纳入95例 LZTR1变异相关NS病例，合并本例胎儿及先证者共97例，涉及79种不同变异位点，呈常染色体隐性遗传43例（44.3%），常染色体显性遗传54例（55.7%）。变异类型以错义变异最常见，无义变异及移码变异多见于复合杂合变异病例中。疾病累及多个器官系统，主要表现为颅面颈部异常、骨骼畸形、先天性心脏病、身材矮小，可合并发育迟缓、学习困难及智力障碍等。描述产前表型的病例18例（18.6%），其中16例 LZTR1变异呈常染色体隐性遗传；超声发现NT增厚11例，颈部水囊瘤7例，胎儿心包、胸腔积液4例，胎儿严重水肿2例，心血管异常11例。 结论:LZTR1变异所致NS为常染色体显性或隐性遗传病，临床表型谱广，相同基因型患儿疾病严重程度不一。超声提示胎儿NT增厚、颈部淋巴水囊瘤、羊水过多、胎儿水肿及先天性心脏缺陷等非特异性表现时应考虑NS的可能。产前识别有助于评估预后，并帮助其家庭做出临床决策。

目的:探讨中国造血干细胞(HSC)捐献人群人类白细胞抗原( HLA)新等位基因形成的分子机制。 方法:选择2008-2014年，山东省血液中心HLA实验室自20 656例HSC捐献者中发现的37个 HLA新等位基因为研究对象。采用 HLA等位基因特异性扩增测序方法确认 HLA新等位基因的碱基序列。 HLA新等位基因在基因数据库(Genbank)进行注册，并且将基因的碱基序列提交世界卫生组织(WHO)HLA系统因子命名委员会，获得正式 HLA等位基因命名。将 HLA新等位基因碱基序列与其碱基序列最相近的已知等位基因进行比较，分析碱基突变情况及其对编码氨基酸的影响。采用血清学HLA分型方法对存在错义突变的 HLA新等位基因所编码HLA的抗原特异性进行鉴定。本研究遵循的程序符合2013年修订版《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。 结果:①本组37个 HLA新等位基因与其序列最相近的已知等位基因比较结果显示，29个 HLA新等位基因为单个碱基替换，5个为2个碱基替换，3个为碱基片段交换或重组。②对9个存在错义突变的 HLA新等位基因所编码HLA的抗原特异性鉴定结果显示， HLA- B*40：96基因编码的抗原为HLA-B40亚型，与 HLA- B*40：96基因碱基序列最相近的已知 HLA等位基因为 HLA- B*40：06：01：01，其编码的抗原为HLA-B61亚型，其余8个 HLA新等位基因编码抗原的特异性与其相应的碱基序列最相近的已知 HLA等位基因所编码的抗原特异性一致。 结论:本实验室发现的中国HSC捐献人群的37个 HLA新等位基因中，碱基替换是形成新等位基因的主要分子机制。

目的 探讨长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)调控糖尿病肾病足细胞损伤的机制.方法 采用葡萄糖诱导小鼠肾足细胞(MPC5)构建足细胞损伤模型.将细胞分为高糖组、高糖+短发夹RNA的阴性对照(sh-NC)组、高糖+干扰LncRNA MEG3表达的短发夹RNA(sh-LncRNA MEG3)组、高糖+sh-LncRNA MEG3+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、高糖+sh-LncRNA MEG3+干扰结节性硬化症复合体1表达的短发夹RNA(sh-TSC1)组和对照组.采用四甲基偶氮唑盐法检测MPC5活性,采用流式细胞术检测MPC5凋亡率,采用实时荧光定量PCR检测LncRNA MEG3相对表达水平,采用Western blot检测自噬相关蛋白[重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)、结节性硬化症复合体1(TSC1)、选择性自噬接头蛋白(p62)和微管相关蛋白轻链3(LC3)]表达,采用荧光原位杂交技术检测LncRNA MEG3的表达定位.结果 高糖组MPC5活性低于对照组,高糖+sh-NC组MPC5 活性低于高糖+sh-LncRNA MEG3组,高糖+sh-LncRNA MEG3+sh-TSC1 组、高糖+sh-LncRNA MEG3+3-MA组 MPC5活性低于高糖+sh-LncRNA MEG3组(均P＜0.01).高糖组MPC5凋亡率高于对照组,高糖+sh-NC组MPC5凋亡率高于高糖+sh-LncRNA MEG3 组,高糖+sh-LncRNA MEG3+sh-TSC1 组、高糖+sh-LncRNA MEG3+3-MA 组 MPC5 凋亡率高于高糖+sh-LncRNA MEG3组(均P＜0.01).高糖组MPC5的LncRNA MEG3相对表达水平高于对照组,高糖+sh-NC组MPC5的LncRNA MEG3相对表达水平高于高糖+sh-LncRNA MEG3组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).高糖组LC3、Beclin-1、TSC1蛋白表达低于对照组,p62蛋白表达高于对照组,高糖+sh-LncRNA MEG3组LC3、Beclin-1、TSC1蛋白表达高于高糖+sh-NC组,p62蛋白表达低于高糖+sh-NC组,高糖+sh-LncRNA MEG3+sh-TSC1组TSC1蛋白表达低于高糖+sh-LncRNA MEG3组,高糖+sh-LncRNA MEG3+3-MA组、高糖+sh-LncRNA MEG3+sh-TSC1 组的 LC3、Beclin-1 蛋白表达低于高糖+sh-LncRNA MEG3组,p62蛋白表达高于高糖+sh-LncRNA MEG3组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).高糖+sh-LncRNA MEG3组TSC1蛋白表达高于高糖+sh-NC组,差异有统计学意义(P＜0.01).LncRNA MEG3在细胞核和细胞质中均可表达.结论 LncRNA MEG3可通过靶向TSC1介导MPC5自噬,进而减轻糠尿病肾病足细胞损伤程度.

目的 应用原核表达系统表达并纯化5种基因型(G Ⅰ.1、G Ⅱ.2、G Ⅱ.3、G Ⅱ.4、G Ⅱ.17)诺如病毒(norovirus,NV)的P2结构域,并制备其抗血清.方法 利用生物信息学方法分析不同基因型NV P2序列保守性,合成P2DNA序列,亚克隆至pET24a载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达.表达的重组P2蛋白纯化后免疫30只雌性BALB/c小鼠,制备抗血清.通过ELISA法检测抗血清的滴度和交叉反应,Western blot法检测抗血清的特异性,点杂交法分析抗血清对野生病毒的识别与结合能力.结果 表达的重组P2蛋白相对分子质量约15 000,纯度均达90％以上,GⅠ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.17型P2蛋白表达量分别为60、26.4、19.8、16.3和33.3mg/L.针对5种基因型NV P2抗原的抗血清滴度均达1∶128 000以上,均能很好地识别自身相应的P2抗原,但不与不相关P2抗原相互作用,均不与重组人A组轮状病毒VP7抗原和重组幽门螺杆菌尿酶抗原发生交叉反应,且对野生型NV具有较好的识别与结合能力.结论 利用原核表达系统成功表达并纯化了我国流行的5种基因型NVP2抗原,制备的抗血清滴度较高,特异性良好,为NV快速、现场诊断技术的建立奠定了基础.

水稻(Oryza sativa)穗部性状与产量直接相关,其相关基因的挖掘与功能解析对于保障国家粮食安全意义重大.以籼稻华占(HZ)和粳稻热研2号(Nekken2)及构建的120个重组自交系(RILs)为实验材料,测定了穗长、每穗粒数、结实率、柱头外露率及一次枝梗数等穗部性状.结合高密度分子遗传图谱进行QTL定位,结果共检测到31个QTLs,分别位于第1、2、3、4、5、6、10和11号染色体上,其中2个位点的LOD值分别高达5.45与5.28.通过分析筛选QTL区间内可能影响穗部性状的相关基因,并利用qRT-PCR进行基因表达检测,发现LOC_Os05g05490、LOC_Os05g06150、LOC_Os03g11700、LOC_Os03g12430、LOC_Os05g28720、LOC_Os05g30890、LOC_Os05g31740和LOC_Os02g17880在双亲间的表达水平差异显著.其中,前5个基因编码三角状五肽重复蛋白,而后3个基因编码糖基转移酶.研究挖掘到31个与穗部性状相关的QTLs,为进一步定位和克隆相关基因,从而选育高产水稻新品种奠定理论基础.

概述目前针灸治疗脑病的病谱,分析针灸治疗脑病临床研究存在的问题,提出针灸治疗脑病的可能策略.针灸治疗脑病的病谱包括23种中枢神经系统(脊髓上中枢)疾病和33种精神与行为障碍病症.针灸治疗脑病的临床研究存在3方面问题:高质量的临床证据不足、针灸治疗脑病的中医理论研究不足和针灸治疗脑病的规律研究不足.笔者提出针灸治疗脑病的五大策略,即刺激脑功能障碍相关的外周神经干,引发外周与中枢的交互作用,并强调自主性康复训练的重要意义,尽早促进脑功能重组;通过刺激三叉神经与蝶腭神经节来改善脑循环、脑代谢;刺激外周神经末梢分布密度高及在脑躯体感觉区投射面积大的部位,以引起较强的脑反应,从而可能对静息状态下脑默认模式网络的工作方式异常起到调整作用;刺激迷走神经改善情绪、抑制脑神经元异常放电,选择星状神经节刺激点以调节下丘脑功能;在治疗脑病的基础上,结合具体情况与症状、体征分类治疗.

倒伏是严重降低油菜产量、品质和影响机械化生产的重要影响因素之一.培育和应用抗倒伏性强的油菜品种是实现油菜机械化生产和高产的重要措施,而提高抗倒伏能力的重点是提高茎秆强度.因此,本研究以包含197个芥菜型油菜株系的重组自交系(RILs,recombinant inbred lines)群体为研究材料,2023年分别在贵阳和贵定两个环境条件下测定了该群体的茎粗、茎秆鲜干比、茎秆充实度、茎秆密度、茎秆抗折力和茎秆抗折强度等6个性状,6个性状均表现出较大的变异,变异系数为14.29％～41.35％,且符合正态分布.相关性分析显示,两个环境条件下,茎秆充实度与茎秆密度、抗折强度二者之间均呈极显著正相关.进一步对茎秆抗折强度表现为高中低的3类材料进行茎秆微观结构观察,相比较于低抗倒材料,高抗倒材料的皮层更厚、维管束个数更多、维管束排列更紧密与维管束面积占比更大.QTL初定位检测到4个QTL与茎秆茎粗有关;2个QTL与茎秆鲜干比有关;2个QTL与茎秆充实度有关;2个QTL与茎秆密度有关;4个QTL与茎秆抗折力有关,可解释的表型变异为4.1％～5.1％;9个QTL与茎秆抗折强度有关,可解释的表型变异为7.5％～11.0％.本研究的开展可为后续芥菜型油菜抗倒伏相关基因的克隆提供基础数据信息,并对油菜抗倒伏育种有一定参考价值.

次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来.次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标.前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控.由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交 cDNA 文库,以HbHDA6 基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与 HbHDA6 相互作用的蛋白.结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为 6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为 1.54×107,文库重组率为 100%.初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为 1.1 kb和 1.2 kb.(2)成功构建了筛选 HbHDA6 互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6 诱饵载体,并确认无自激活活性.(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了 22 个与HbHDA6 发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6 等.该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索.

目的 构建人程序性死亡受体配体 1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)免疫球蛋白可变区(immunoglo-bulin variable region,IgV)结构域基因酵母双杂交重组诱饵质粒,检测其在酵母中的表达情况,检测PD-L1 IgV蛋白细胞毒性和自我激活,以及PD-L1 IgV与人硫氧还蛋白(human thioredoxin,hTrx)之间的相互作用情况.方法 利用生物信息学方法对人PD-L1进行分析,并根据NCBI GenBank数据库中登录的PD-L1基因编码区序列设计扩增PD-L1 IgV结构域的引物,以pENTER-PD-L1质粒为模板进行PCR扩增,克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7.将鉴定正确的重组诱饵质粒及pGBKT7空载体分别转化至Y2HGold酵母细胞,PCR及Western blot法检测PD-L1 IgK基因及蛋白的表达;同时检测PD-L1 IgV蛋白毒性及自我激活效应,并采用滴板法检测诱饵蛋白PD-L1 IgV与hTrx相互作用情况.结果 PD-L1的生物信息学分析结果与相关报道一致;成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgV,并获得Y2HGold阳性克隆子,PD-L1 IgV能在其中稳定表达.空载体pGBKT7、重组诱饵质粒pGBKT7-PD-L1 IgK在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长良好,菌落大小、数量一致,呈白色,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上两者均不生长,表明PD-L1 IgV蛋白对酵母无毒性且无自我激活效应;滴板法试验结果显示,所有实验组在SD/-Trp/-Leu平板上生长良好,仅阳性对照组可在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上生长且呈蓝色,表明诱饵蛋白PD-L1 IgV、hTrx不存在自我激活现象,且两者之间也不存在相互作用.结论 成功构建了重组人PD-L1 IgV酵母双杂交诱饵质粒,PD-L1 IgV蛋白对酵母细胞无毒性且无自我激活效应,且与hTrx之间无相互作用.后续可利用hTrx构建肽适体文库,从中筛选可与PD-L1 IgV特异结合的肽适体.