目的:确定环腺苷酸(cAMP)受体蛋白(CRP)对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)肠杆菌素铁载体相关基因 entC的调控机制。 方法:以CRKP-27野生株构建 crp基因缺失株Δ crp和回补株c-Δ crp。利用铬天青S(CAS)定量试验观察CRP对CRKP铁载体分泌量的影响。RT-qPCR试验和 lacZ报告基因融合试验研究CRP对 entC表达及对其启动子的调控。凝胶阻滞试验(EMSA)确定CRP是否与 entC启动子区结合，DNaseⅠ足迹试验进一步确定结合序列。 结果:成功构建Δ crp和c-Δ crp菌株；在正常条件和缺铁条件下，Δ crp菌株的铁载体分泌量均高于野生株和c-Δ crp菌株，但仅在正常环境中有统计学意义( P<0.05)；正常条件和缺铁条件下，Δ crp菌株中 entC基因的mRNA相对表达量较野生株和c-Δ crp菌株明显降低( P均<0.05)；正常条件和缺铁条件下，Δ crp菌株中 entC基因的启动子活性低于野生株和c-Δ crp菌株( P均<0.05)；EMSA结合试验显示随着CRP蛋白量的增加， entC探针朝正极移动的距离都相应缩短，出现阻滞现象；DNaseⅠ足迹试验进一步检测到 entC启动子区与CRP特异性结合位点为：5′-AAGGTGATAAATGCGTCTCATTTTCAA-3′。 结论:CRKP中CRP能特异地结合到 entC启动子区并直接促进其转录表达。

目的:探索csn2基因缺失对变异链球菌（ Streptococcus mutans，Sm）饥饿耐受和寡营养环境下胞外多糖合成的影响。 方法:培养Sm csn2基因的缺失菌株及回补菌株，通过设置不同浓度梯度培养基创造寡营养生长环境供其生长。生长曲线检测寡营养生长环境下Sm的生长，结晶紫染色，扫描电镜、激光共聚焦显微镜检测寡营养生长环境下Sm的生物膜表型，蒽酮硫酸法检测Sm生物膜中胞外多糖的量，实时荧光定量PCR检测胞外多糖合成相关基因的表达。结果:生长曲线结果显示csn2基因缺失抑制了饥饿胁迫下Sm的生长，激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示野生型菌株、csn2基因缺陷株、回补菌株在营养充足培养条件下所得生物膜胞外多糖/细菌比值为0.44±0.07、1.05±0.13和0.57±0.08，在寡营养条件下所得生物膜胞外多糖/细菌比值为0.93±0.24、3.05±0.21和1.32±0.46，表明csn2基因缺失增强了Sm在寡营养环境下胞外多糖的合成能力；在饥饿胁迫下，胞外多糖合成相关基因gtfB、gtfC的表达水平分别显示出2.5和1.8倍的增加，gtfD的表达水平下调2/3。结论:csn2基因对Sm的生理功能及毒力特性表现出多种影响，包括饥饿耐受和胞外多糖合成，这些改变可能与csn2基因缺失引发复杂的调控网络相关。

目的:探讨我国华东地区2017—2021年临床分离侵袭性感染热带念珠菌的标本来源分布及耐药特征。方法:采用回顾性分析。华东地区侵袭性真菌感染协作组（East China Invasive Fungal Infection Group，ECIFIG）收集2017年1月至2021年12月间我国华东地区32家医院临床分离的热带念珠菌，由上海市东方医院南院检验科真菌实验室作为中心实验室，以质谱法复核菌株鉴定结果，采用ThermoFisher CMC1JHY比色微量稀释法检测菌株对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、艾沙康唑、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净和5-氟胞嘧啶的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MIC），微量肉汤稀释法检测菌株对两性霉素B的MIC，按美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M27M44s-Ed3和M57s-Ed4判定结果。采用Kruskal-Wallis 检验法和配对 t检验进行数据分析。 结果:共收集到热带念珠菌305株，主要标本来源为血38.0%（116/305）、腹水11.5%（35/305）、导管8.9%（27/305）和引流液8.9%（27/305）。其对氟康唑耐药率为32.5%，对伏立康唑耐药率为28.5%，对氟康唑和伏立康唑交叉耐药率为28.5%；伊曲康唑和泊沙康唑野生型占比分别为79.3%和29.2%。氟康唑与伏立康唑耐药率、MIC 50、MIC 90、伊曲康唑和泊沙康唑野生型占比等五年间无显著变化。95.0%以上菌株对棘白菌素类药物敏感，但发现1株棘白菌素耐药的多重耐药热带念珠菌。唑类药物中，伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑和艾沙康唑GM MIC相似，氟康唑GM MIC显著高于伊曲康唑（ t=9.95， P<0.05）、泊沙康唑（ t=9.99， P<0.05）和伏立康唑（ t=10.01， P<0.05），而棘白菌素类药物中，阿尼芬净的GM MIC与卡泊芬净相当（ t=1.17， P>0.05），均显著高于米卡芬净（ t=11.56， P<0.05， t=4.15， P<0.05）。 结论:2017—2021年华东地区临床分离热带念珠菌对棘白菌素类药物较为敏感，对氟康唑和伏立康唑持续呈高耐药水平，应加强对热带念珠菌的耐药性监测。

目的:探究与自身抗体抗线粒体抗体Ⅱ型（AMA-M2）发生反应的侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白（BCOADC-E2）关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎（PBC）诊断中的价值。方法:克隆能够表达BCOADC-E2蛋白抗原表位同源目的基因序列BCKD，与工程质粒pGEX-4T1进行DNA重组，通过PCR获得15个点突变质粒，转入原核表达菌株中进行蛋白表达与纯化；ELISA法、蛋白质印迹法鉴定其与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度并进行分析比较，定位出对BCOADC-E2蛋白和AMA-M2特异性反应有关键影响的氨基酸，探讨其在PBC诊断中的价值。统计学处理采用单因素方差分析、两两比较采用LSD- t检验。 结果:共获得14个突变型蛋白、1个野生型蛋白。突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A和pGEX-BCKD-C3A与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD与AMA-M2特异性反应程度；突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A（1.634±0.328）和pGEX-BCKD-C3A（1.744±0.345）与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD（1.000±0.000）与AMA-M2特异性反应程度；突变型蛋白pGEX-BCKD-E4A（0.157±0.067）、pGEX-BCKD-V5A（0.057±0.029）、pGEX-BCKD-Q6A（0.580±0.166）、pGEX-BCKD-S7A（0.744±0.125）、pGEX-BCKD-D8A（0.351±0.135）、pGEX-BCKD-S10A（0.496±0.158）、pGEX-BCKD-V11A（0.149±0.089）、pGEX-BCKD-T12A（0.061±0.043）、pGEX-BCKD-I13A（0.007±0.017）、pGEX-BCKD-T14A（0.198±0.101）、pGEX-BCKD-S15A（0.156±0.087）、pGEX-BCKD-R16A（0.884±0.099）与AMA-M2特异性反应程度均低于野生型蛋白pGEX-BCKD（1.000±0.000）与AMA-M2特异性反应蛋白。结论:BCOADC-E2蛋白的1号和3号位半胱氨酸是提高蛋白BCOADC-E2与PBC患者血清AMA-M2特异性反应关键性氨基酸；4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16号位氨基酸被丙氨酸代替后形成突变型蛋白会降低其与AMA-M2特异性反应程度；5号位和13号位氨基酸是影响蛋白BCOADC-E2与AMA-M2特异性反应关键性氨基酸，对BCOADC-E2蛋白功能有着重要影响，对BCOADC-E2关键性氨基酸进行深入研究对PBC诊治有重要意义。

目的:探究LiaSR双组分信号转导系统对变异链球菌（Sm）593号（Sm 593）临床株耐酸和生物膜形成的影响及相关机制。方法:以Sm 593及其liaS和liaR基因敲除株为研究菌株，采用全自动生长曲线测定仪检测并绘制pH=5.5环境中各菌株的生长曲线；用菌落计数法检测细菌的适应性耐酸能力；使用Laurdan探针、氢-钾腺苷三磷酸（ATP）酶试剂盒、质子通透性检测实验和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）探究LiaSR双组分信号转导系统介导的耐酸机制。体外构建各菌株的生物膜，通过结晶紫染色法、菌落计数法、SYTOX探针检测法和蒽酮-硫酸法探究各菌株的生物膜总量、活菌数、胞外DNA（eDNA）和胞外多糖含量；采用RT-qPCR法检测胞外多糖合成相关基因的表达情况。结果:pH=5.5环境中，liaS和liaR基因敲除株的生长受到显著抑制（ P<0.05）。适应性耐酸曲线显示敲除株与野生株相比，固有耐酸和适应性耐酸能力均显著下降（ P<0.05）。对三菌株无预酸化处理20和40 min以及预酸化处理20和40 min后，liaS基因敲除株生存率［（8.98±2.00）%、（0.18±0.07）%、（14.88±8.64）%、（0.82±0.91）%］和liaR基因敲除株生存率［（0.38±0.19）%、（0.34±0.18）%、（7.89±2.02）%、（1.52±0.37）%］均分别显著低于野生株［（32.49±9.75）%、（1.27±0.32）%、（62.76±29.06）%、（8.02±1.25）%］（均 P<0.05）。此外，liaS和liaR敲除株膜流动性（0.18±0.04和0.18±0.05）均显著低于野生株（0.08±0.05）（均 P<0.01）；不饱和脂肪酸合成基因fabM表达水平（0.52±0.11和0.57±0.05）与野生株（1.04±0.30）相比均显著降低约1/2（均 P<0.001）；H +-ATP酶活性（917.06±59.53和469.53±47.65）与野生株（127.00±50.71）相比显著升高7.22和3.70倍（均 P<0.001），且编码H +-ATP酶基因atpD的表达水平（3.39±0.21和1.94±0.17）也较野生株（1.00±0.15）显著升高3.39和1.94倍（均 P<0.01）。liaR基因敲除株的终末pH值（4.76±0.01）显著低于野生株（4.90±0.00），liaS基因敲除株的终末pH值（5.19±0.01）显著高于野生株（均 P<0.001）。liaS和liaR基因敲除株与野生株相比，Sm 593生物膜总量未发生明显变化，生物膜活菌数均显著少于野生株（均 P<0.05），且eDNA含量均显著高于野生株（均 P<0.01）。liaS基因敲除株生物膜水溶性多糖含量与野生株相比显著增加1.88倍（ P=0.003）。liaS和liaR基因敲除株胞外多糖合成相关基因gtfD表达水平较野生株显著升高47.43和16.90倍（均 P<0.05），liaS基因敲除株中gtfC基因比野生株显著高表达1.65倍（ P=0.014）。 结论:LiaSR双组分信号转导系统通过调控膜不饱和脂肪酸合成和胞膜流动性，参与Sm 593的耐酸过程；LiaR反应调节蛋白还可参与调节膜质子通透性，增强Sm 593的耐酸能力；此双组分信号转导系统可负向调控生物膜胞外基质的产生。

目的:研究转录调控因子OmpR在创伤弧菌中致病相关的生物学功能及分子机制。方法:通过基因无痕敲除技术构建创伤弧菌 ompR基因敲除株(Δ ompR)。通过生长曲线测定法检测不同渗透压下菌株的耐受力，细菌泳动试验检测运动性，结晶紫染色试验检测细菌生物膜形成能力，菌落计数法测定创伤弧菌Δ ompR株黏附细胞的变化，乳酸脱氢酶释放法测定创伤弧菌Δ ompR株对细胞毒性的变化，以明确Δ ompR株的致病性相关生物学表型；实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)法检测创伤弧菌Δ ompR株和野生株中毒力相关靶基因 ompN、 ompU、 ompA、 hcp2的mRNA水平变化。 结果:成功构建创伤弧菌Δ ompR株。与野生株相比，Δ ompR株在高渗透压培养基中生长缓慢，生物膜形成能力减弱，细菌运动性未有明显差异，Δ ompR株对细胞的黏附率和毒性显著低于野生株。Δ ompR株中渗透压调节及生物膜形成相关 ompN基因mRNA水平显著下调( P<0.05)，其他靶基因mRNA水平无明显变化。 结论:OmpR参与调控创伤弧菌高渗透压环境下生长、生物膜形成、对细胞的黏附及毒性。

目的:建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法，并使用荧光菌株Cm-mCherry构建有效的衣原体感染模型。方法:构建含有红色荧光蛋白mCherry的重组质粒pmCherry：：CM，利用氯化钙法将pmCherry：：CM转化至衣原体质粒缺失株CMUT中，经过筛选与纯化得到荧光菌株Cm-mCherry。Cm-mCherry感染HeLa229细胞后观察包涵体中红色荧光的发光情况，并与间接免疫荧光染色法比较，评估细胞感染模型构建是否成功；Cm-mCherry感染小鼠后，通过测定下生殖道载菌量、冷冻切片观察上生殖道衣原体红色荧光、分离生殖道评价输卵管积水发病情况，确定Cm-mCherry的感染力、侵袭力与致病性，评估动物感染模型构建是否成功。结果:红色荧光蛋白mCherry在转化株Cm-mCherry中稳定表达，红色荧光蛋白标记法与间接免疫荧光染色法一致度高；Cm-mCherry小鼠感染模型中，感染率为100%(10/10)，下生殖道载菌量可稳定保持高水平，在上生殖道冷冻切片中可观察到带有红色荧光的包涵体，输卵管积水发病程度与Cm野生株差异无统计学意义( P>0.05)，证实Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性。 结论:成功建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法，转化后的荧光菌株Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性，可用于衣原体细胞、动物感染模型的构建，为研究衣原体感染机制提供良好的实验工具。

目的:探讨体外特殊条件下鼠衣原体( Chlamydia muridarum, Cm)连续传代培养后在感染性、生长发育以及致病性等生物学性状上的变化，为筛选减毒活疫苗，筛查毒力相关基因提供依据。 方法:将实验室 Cm野生株(G0)通过常规细胞培养，在辅助或不辅助培养条件下交替连续传代后，将亲本株G0与获得的传代株G28进行衣原体感染离心依赖性、细胞吸附能力、衣原体感染细胞生长曲线、衣原体形成的噬斑大小以及两种菌株在感染小鼠生殖道后所形成的输卵管病变情况进行检测。 结果:与亲本株G0相比，传代株G28对感染离心条件的依赖性显著下降( P<0.05)；对感染细胞的吸附能力却明显上升( P<0.05)；G0与G28在感染细胞32 h内的生长曲线差异并无统计学意义；在感染细胞中所形成的噬斑大小也无明显区别；但体内毒力试验中，G0感染小鼠后致输卵管病变率为87.5%，而G28的输卵管病变率仅为37.5%，两者形成差异有统计学意义。 结论:Cm传代株G28与亲本株G0相比，在感染能力显著增强的情况下，其致病性却显著降低，为后续鉴定毒力基因，进一步提取基因型单一的减毒株并应用于衣原体减毒活疫苗带来了希望。

目的:探讨不同实验条件对淋病奈瑟球菌（淋球菌）体外转化效率的影响。方法:以淋球菌D株DNA为模板扩增penA基因，采用重叠延伸PCR制备penA A501V（耐药突变）基因，购买淋球菌penA H041基因（耐药阳性对照）。制备含penA/penA A501V/penA H041基因的质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白筛选培养基克隆扩增；分别采用日本TaKaRa公司质粒提取试剂盒和天根生化科技（北京）有限公司高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。以penA质粒、penA A501V质粒、penA H041质粒、penA A501V基因、penA H041基因为底物采用直接孵育法转化淋球菌受体菌株A43、A49，测定转化率（CFU/μg）及头孢曲松（CRO）的最小抑菌浓度（MIC）。以penA A501V、penA H041基因为底物，采用脂质体法转化受体菌株A43、A49，观察转化效率及头孢曲松的MIC。 结果:以D株淋球菌DNA为模板，成功获得1 749 bp的penA及penA A501V基因。提取质粒并电泳后，TaKaRa试剂盒提取的含淋球菌penA、penA A501V、penA H041基因的质粒主要集中在2 500 bp处，迁移速度较快；天根试剂盒提取的质粒主要集中在5 000 bp处，迁移速度较慢。直接孵育法转化时，含野生型penA的A43株的MIC为0.001 μg/ml，转入penA质粒后MIC上升至0.002 μg/ml，转入penA A501V质粒和penA A501V基因转化株MIC均为0.004 μg/ml，转入阳性对照penA H041质粒和penA H041基因后MIC均升至0.512 μg/ml；各底物孵育后CRO对A49株的MIC值与空白对照相同，均为0.016 μg/ml。脂质体法转化时，含野生型penA的A43株对CRO的MIC是0.002 μg/ml，A49株MIC为0.016 μg/ml；penA A501V基因转化A43株后MIC升至0.004 μg/ml，转化A49株后仍为0.016 μg/ml；阳性对照penA H041基因转化A43和A49株后MIC均升至0.250 μg/ml，较空白对照分别升高至125倍和15.6倍。 结论:选择质粒为底物采用直接孵育法对A43株淋球菌有较好转化效率，不同质粒提取方法可能影响转化效率，对于直接孵育法转化效率不高的A49株可采用脂质体法。

目的:构建高毒力肺炎克雷伯菌NTHU-K2044菌株 hfq基因缺失株(△ hfq)，并通过表型试验分析 hfq基因对高毒力肺炎克雷伯菌生长特性、环境适应能力和毒力等生物学特性的影响。 方法:利用同源重组技术对NTUH-K2044菌株进行 hfq基因敲除；通过表型试验，比较高毒力肺炎克雷伯菌野生株和△ hfq突变株在细菌生长速度、抗环境胁迫能力、生物膜形成、荚膜形成中性粒细胞杀菌活性和大蜡螟幼虫感染致死率等方面的差异性。 结果:成功构建高毒力肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 △ hfq缺失株，表型试验表明△ hfq缺失株的生长速度显著减慢，菌落变小和超黏性下降；在pH9、pH5.5、0.7 mmol/L SDS、5% NaCl、0.1%H 2O 2环境和50℃高温等环境胁迫条件下，△ hfq缺失株生长受到显著抑制；在毒力方面，△ hfq缺失株生物膜形成能力下降，荚膜形成能力下降且荚膜合成基因 magA和 rmpA表达量明显下降，中性粒细胞杀菌试验存活率下降，大蜡螟幼虫致死能力显著降低。 结论:Hfq蛋白作为RNA伴侣分子能够参与转录后调控进而对高毒力肺炎克雷伯菌生理、环境适应性及毒力致病性具有重要的调控作用。这为寻找治疗和控制高毒力高耐药肺炎克雷伯菌新靶标提供了基础。