目的:评价臂旁核乙酰胆碱转移酶(ChAT)阳性神经元与小鼠恐惧记忆形成的关系。方法:健康雄性ChAT-ires-cre小鼠18只，8~9周龄，体重22~25 g，采用随机数字表法分为3组( n＝6)：Cre依赖AAV-DIO-hM 3Dq-mcherry(Gq)病毒/氯氮平-N-氧化物(CNO)组、Gq/生理盐水(NS)组和Cre依赖AAV-DIO-mcherry (mc)病毒/CNO组。Gq/CNO组小鼠臂旁核注射Gq病毒，3周后腹腔注射CNO 2 mg/kg；Gq/NS组小鼠臂旁核注射Gq病毒，3周后腹腔注射等容量生理盐水；mc/CNO组小鼠臂旁核注射mc病毒，3周后腹腔注射CNO 2 mg/kg。3组小鼠均于腹腔注射后30 min进行条件性恐惧实验。再进行全脑切片，观察病毒表达情况及ChAT阳性神经元投射脑区。 结果:与Gq/CNO组比较，Gq/NS组和mc/CNO组测试阶段僵立状态时间百分比升高( P<0.05)。Gq/mc病毒携带的荧光蛋白mcherry表达于小鼠臂旁核神经元，并与mcherry-ChAT存在共表达；ChAT阳性神经元的神经纤维投射到红核、黑质、中央杏仁核、丘脑前背侧核、终纹床核。 结论:臂旁核ChAT阳性神经元参与了恐惧记忆形成的调控，其被激活后会导致恐惧记忆受损，此调控可能是通过中央杏仁核实现的。

目的:研究小鼠中缝背核（DRN）中5-羟色胺（5-HT）能神经元的下游投射特征和DRN中投射向不同脑区5-HT能神经元的解剖分布差异。方法:将特异性顺向示踪病毒rAAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry注射至Sert-Cre小鼠（3只）的DRN，病毒表达4周后将小鼠灌注取脑，并将全脑切成厚度为40 μm的冠状脑片，进行全玻片免疫荧光成像扫描，观察DRN中5-HT能神经元投射向下游的脑区分布。将特异性逆向示踪病毒rAAV2/retro-EF1α-DIO-BFP、rAAV2/retro-EF1α-DIO-mCherry和rAAV2/retro-EF1α-DIO-EGFP分别注射到Sert-Cre小鼠（3只）的伏隔核（NAc）、中央杏仁核（CeA）和腹侧被盖区（VTA），病毒表达4周后将小鼠灌注取脑，制备包含NAc、CeA、VTA和DRN的脑切片于共聚焦荧光显微镜下观察病毒标记的5-HT能神经元在DRN中解剖分布情况。结果:DRN的5-HT能神经元向全脑发出广泛投射，包括梨状皮质、内侧前额叶皮质、NAc、基底前脑、CeA、外侧僵核、外侧下丘脑、VTA等。其中，投射向NAc的5-HT能神经元主要分布在DRN的背侧中央区和外侧区，投射向CeA的5-HT能神经元主要位于DRN的背外侧区，投射向VTA的5-HT能神经元主要位于DRN的腹侧束间部。结论:投射向不同脑区的5-HT能神经元在DRN的解剖学分布中存在差异，提示DRN内的5-HT能神经元存在相对独立的多个平行的亚系统。

目的:通过化学遗传学技术构建胰升糖素样肽1(GLP-1)神经元可控性模型大鼠，并观察GLP-1神经元兴奋性的变化对食欲的调控作用。方法:将15只大鼠分为绿色荧光蛋白(GFP)组、HM3D组和HM4D组，每组5只。分别在3组大鼠的孤束核区域注射不同组合的腺相关病毒(rAAV)，GFP组在孤束核区域注射rAAV-GLP-1-cre和rAAV-GFP-dio；HM3D组在孤束核区域注射rAAV-GLP-1-cre和rAAV-HM3D-mCherry-dio；HM4D组在孤束核区域注射rAAV-GLP-1-cre和rAAV-HM4D-mCherry-dio。通过观察腹腔注射不同剂量N-氧化氯氮平(CNO)后大鼠的摄食行为和体重变化来筛选其最佳剂量。通过与腹腔注射生理盐水进行比较来确认GLP-1神经元的可调控性。观察大鼠处死前30 min注射CNO后大鼠孤束核区域GLP-1神经元的激活数量及下丘脑POMC神经元的表达。结果:各组大鼠孤束核区域内GLP-1神经元均成功被标记，CNO注射剂量为1mg/kg时，HM3D组大鼠摄食减少( P＝0.021)，而HM4D组大鼠摄食增加( P＝0.002)。而注射剂量为0.5 mg/kg和3 mg/kg时均未出现此效应。免疫荧光结果显示，HM3D组孤束核中GLP-1神经元的兴奋性高于GFP组( P＝0.022)，GFP组高于HM4D组( P＝0.049)。腹腔注射CNO后HM3D组大鼠孤束核区域内的GLP-1神经元及下丘脑的POMC神经元表达也高于HM4D组( P＝0.003)。 结论:通过化学遗传学技术在大鼠孤束核内注射不同组合的rAAV能够成功建立GLP-1神经元可控性模型大鼠。1 mg/kg的CNO剂量能够有效激活或抑制该神经元，从而产生调控食欲的效应。

目的:探讨脑胶质瘤U251多倍体巨细胞的体外构建方法并研究其对替莫唑胺的耐药性。方法:通过慢病毒感染实验观察带有不同荧光标记的人脑胶质瘤U251细胞；采用植物血凝素-聚乙二醇融合法进行细胞融合；通过流式细胞分选实验检测体外携带双色荧光标记的胶质瘤多倍体巨细胞；采用碘化丙啶染色方法测定U251融合克隆细胞的DNA含量；通过CCK-8实验评价细胞的增殖率以及加入替莫唑胺后细胞的存活率。结果:慢病毒感染实验成功获得分别带有绿色和红色荧光标记的胶质瘤U251细胞；细胞融合后显微镜下可见携带双色荧光的胶质瘤融合细胞，并且与聚乙二醇细胞融合法比较，植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法的细胞融合率明显提高(自<1%提高至>5%)。流式细胞分选获得胶质瘤U251融合细胞单克隆株。DNA含量的检测结果显示，U251融合克隆细胞的DNA含量自之前的2N/4N提高至4N/8N。CCK-8实验结果显示，U251细胞接种后1、2、3、4及5 d的细胞增殖率分别为(99.5±2.6)%、(236.7±4.7)%、(348.9±8.8)%、(656.5±18.5)%及(715.7±48.2)%；而U251-C1多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.6±2.1)%、(114.5±1.3)%、(138.4±1.7)%、(316.7±23.1)%及(347.7±13.1)%，U251-C2多倍体巨细胞的细胞增殖率分别为(100.3±1.2)%、(114.7±1.2)%、(186.4±0.6)%、(307.1±9.5)%及(432.9±37.7)%，相较于胶质瘤U251细胞，U251多倍体巨细胞的不同克隆株(U251-C1、U251-C2)的增殖速度均明显减慢(均 P<0.05)。替莫唑胺作用下，U251细胞和U251多倍体巨细胞(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均下降(均 P<0.01)，而与U251细胞组比较，不同U251多倍体巨细胞株(U251-C1、U251-C2)的细胞存活率均更高(均 P<0.01)。 结论:植物血凝素-聚乙二醇细胞融合法可在体外成功构建脑胶质瘤U251多倍体巨细胞；胶质瘤U251多倍体巨细胞可能对替莫唑胺的耐药性发挥重要作用。

目的:探讨丘脑室旁核（paraventricular nucleus of thalamus, PVT）谷氨酸能神经元在艾司氯胺酮麻醉中的调控作用。方法:研究全部选择8~10周龄雄性Vglut2-cre转基因小鼠。取3只小鼠在PVT区立体定位注射钙信号病毒rAAV-EF1α-DIO-GCaMp6s-WPRE-hGH pA，3周后采用钙信号光纤记录技术观察艾司氯胺酮麻醉前后PVT谷氨酸能神经元的活性变化。取10只小鼠采用随机数字表法分为光遗传激活组（ChR2组）和光遗传对照病毒组（mCherry1组），每组5只，分别在PVT区立体定位注射兴奋性光遗传学病毒rAAV-EF1α-DIO-hChR2（H134R）-mCherry-WPRE-hGH pA或对照病毒rAAV-EF1a-mCherry-WPRE-hGH pA，并埋置刺激光纤，3周后采用光遗传学技术激活PVT谷氨酸能神经元，观察麻醉维持期mCherry1组和ChR2组脑电频谱及各频段百分比总功率变化。取16只小鼠采用随机数字表法分为化学遗传抑制组（hM4Di组）和化学遗传对照病毒组（mCherry2组），每组8只，分别在PVT区立体定位注射抑制性化学遗传病毒rAAV-EF1α-DIO-hM4D（Gi）-mCherry-WPREs pA或对照病毒，3周后采用化学遗传学技术抑制PVT谷氨酸能神经元，观察mCherry2组和hM4Di组诱导时间和觉醒时间的变化。结果:与清醒基线比较：PVT谷氨酸能神经元钙信号在麻醉诱导期明显增加（ P<0.05），持续300~500 s，麻醉期明显下降（ P<0.05），小鼠翻正反射恢复（recovery of righting reflex, RORR）后钙信号与麻醉期比较差异无统计学意义（ P>0.05），但其低于清醒基线水平（ P<0.05）。采用光遗传学方法激活PVT谷氨酸能神经元：与刺激前比较，ChR2组刺激中δ频段的百分比总功率明显下降（ P<0.05），α频段的百分比总功率明显增加（ P<0.05），其他频段差异无统计学意义（ P>0.05）。化学遗传抑制PVT谷氨酸能神经元：与mCherry2组比较，hM4Di组觉醒时间延长（ P<0.01），但两组诱导时间差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:PVT谷氨酸能神经元参与艾司氯胺酮麻醉和觉醒过程，激活PVT谷氨酸能神经元可促进艾司氯胺酮麻醉觉醒。

目的:建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法，并使用荧光菌株Cm-mCherry构建有效的衣原体感染模型。方法:构建含有红色荧光蛋白mCherry的重组质粒pmCherry：：CM，利用氯化钙法将pmCherry：：CM转化至衣原体质粒缺失株CMUT中，经过筛选与纯化得到荧光菌株Cm-mCherry。Cm-mCherry感染HeLa229细胞后观察包涵体中红色荧光的发光情况，并与间接免疫荧光染色法比较，评估细胞感染模型构建是否成功；Cm-mCherry感染小鼠后，通过测定下生殖道载菌量、冷冻切片观察上生殖道衣原体红色荧光、分离生殖道评价输卵管积水发病情况，确定Cm-mCherry的感染力、侵袭力与致病性，评估动物感染模型构建是否成功。结果:红色荧光蛋白mCherry在转化株Cm-mCherry中稳定表达，红色荧光蛋白标记法与间接免疫荧光染色法一致度高；Cm-mCherry小鼠感染模型中，感染率为100%(10/10)，下生殖道载菌量可稳定保持高水平，在上生殖道冷冻切片中可观察到带有红色荧光的包涵体，输卵管积水发病程度与Cm野生株差异无统计学意义( P>0.05)，证实Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性。 结论:成功建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法，转化后的荧光菌株Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性，可用于衣原体细胞、动物感染模型的构建，为研究衣原体感染机制提供良好的实验工具。

目的:探讨终纹床核(BNST)GABA能神经元在小鼠异氟烷全麻-觉醒中的作用。方法:健康雄性Vgat-Cre转基因小鼠23只，8～10周龄，体质量约22 g。免疫荧光染色实验：取8只小鼠，采用随机数字表法分为2组( n＝4)：氧气组和异氟烷组。氧气组吸入1.0 L/min氧气2 h，异氟烷组吸入1.4%异氟烷＋1.0 L/min氧气2 h，随后处死小鼠，取脑组织，用免疫荧光染色法测定c-Fos阳性表达及其与GABA能神经元的共标率。光遗传学实验：取15只小鼠，采用随机数字表法分为3组( n＝5)：对照组(CON组)、光遗传兴奋组(CHR2组)和光遗传抑制组(eNpHR组)，分别于BNST脑区注射rAAV-Ef1a-DIO-mCherry、rAAV-Ef1a-DIO-CHR2-mCherry和rAAV-Ef1a-DIO-eNpHR3.0-mCherry病毒。待病毒表达3周后，小鼠吸入1.0%异氟烷＋1.0 L/min氧气，同时检测皮层脑电，当小鼠进入稳定麻醉状态时，采用光遗传方法调控BNST脑区GABA能神经元活力，记录光刺激前2 min与刺激2 min时皮层脑电爆发性抑制率(BSR)。 结果:与氧气组相比，异氟烷组BNST脑区c-Fos与GABA神经元共标率降低( P<0.05)，c-Fos阳性神经元减少。与CON组或光刺激前相比，CHR2组光刺激时BSR降低( P<0.001)，eNpHR组BSR差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:BNST脑区GABA能神经元活力降低可能参与异氟烷麻醉小鼠意识消失过程，BNST脑区GABA能神经元活力升高促进麻醉向觉醒转换。

目的:探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法:①选择 GATA1基因为目的基因，利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂)，并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后，选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增，以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入，以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆，进行细胞培养后，提取H1细胞单克隆基因组，并且分别采用引物对1/2( GATA1 5′端臂外引物/ mCherry 3′端引物)和3/5( HygroR 5′端引物/ GATA1 3′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增，以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验，以确认基因编辑是否改变H1细胞特性，以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞，置于相同的造血分化培养条件培养14 d后，分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察，并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞，进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞，进行GATA1特异抗体染色体，观察其能否准确追踪并指示GATA1。 结果:①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后，H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示，H1细胞经电穿孔后，可获得2 710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带；电泳条带为2 710 bp，说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列，但是Cre没有去除筛选标志物；条带大小为945 bp，说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列，并且Cre已去除筛选标志物，为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示，打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时，荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光，FCM检测结果显示，未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比，造血干/祖细胞群比例相似，二者CD34 +CD45 +细胞比例分别为12.4%和14.1%，CD34 +CD45 +细胞比例分别为17.0%和20.2%，表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③ GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示，荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物，表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对 GATA1基因的标记是准确且特异的。 结论:本研究以 GATA1为目的基因，在hPSC中快速、高效进行基因敲入，成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。

目的:探究双链RNA结合蛋白核因子（NF45）在喉鳞状细胞癌（LSCC）中的表达，及其对LSCC细胞辐射敏感性的影响及机制。方法:实时反转录PCR（RT-qPCR）和免疫组化染色检测LSCC及癌旁组织内NF45表达。将NF45-shRNA慢病毒转染至Hep-2细胞，RT-qPCR和蛋白质印迹法（WB）测定细胞转染效果。将Hep-2细胞分为对照组、2 Gy组、sh-NC+2 Gy组和sh-NF45+2 Gy组，进行慢病毒感染和2 Gy X射线照射处理，CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术测定细胞凋亡率。采用mCherry-EGFP-LC3B处理各组Hep-2细胞，免疫荧光染色检测细胞自噬水平，WB测定细胞内自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值及Beclin-1、p62蛋白表达水平。结果:NF45在LSCC组织中的表达水平显著高于癌旁组织（ P<0.01）。感染NF45-shRNA的Hep-2细胞中NF45 mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著低于对照组和sh-NC组（ P值均<0.05）。与对照组比较，2 Gy组、sh-NC+2 Gy组及sh-NF45+2 Gy组细胞增殖活性均降低，细胞凋亡率增加，细胞内自噬溶酶体增多，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值升高，Beclin-1蛋白相对表达量增加，p62蛋白相对表达量减少（ P值均<0.05）。与2 Gy组比较，sh-NF45+2 Gy组细胞增殖活性降低且细胞凋亡率增加，同时，细胞内自噬溶酶体增多，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值升高，Beclin-1蛋白相对表达量增加，p62蛋白相对表达量减少（ P值均<0.05）。 结论:NF45在LSCC组织中表达升高，靶向下调NF45表达能够抑制LSCC细胞增殖活性，促进细胞凋亡，提高肿瘤细胞的辐射敏感性，该机制可能与调控细胞自噬水平有关。

目的:探讨上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles，UCNPs）结合980 nm近红外光（near infrared，NIR）能否通过激发可见光激活光敏蛋白（channelrhodopsin-2，ChR2）成功夺获心肌。方法:15只SD幼鼠按随机数字表法随机分为光敏蛋白（ChR2）组（5例）、红色荧光蛋白（mCherry）组（5例）和对照组（5例），分别经颈静脉注入带有相应基因的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体AAV9-CAG-hChR2（H134R）-mCherry、AAV9-CAG-mCherry和磷酸盐缓冲盐溶液（PBS），8周后开胸暴露心脏实施在体实验。自制包含UCNPs的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）透光薄膜，将薄膜贴附于右心室游离壁，980 nm NIR经程序设置脉冲参数，由400 μm芯径光纤输出，至于薄膜上方，同步记录NIR输出信号及体表心电图，观察NIR夺获右心室心肌的情况。结果:ChR2组大鼠心肌可被NIR激发转换出的可见光（包含波长450 nm和475 nm的蓝光）夺获，并且随着NIR输出功率的增加1~6 W，心肌夺获率可增加至100%，随着NIR脉冲宽度的增加（5、10、20、50 ms），夺获心脏的NIR输出功率逐渐减小。而mCherry组和对照组大鼠心脏对980 nm NIR经UCNPs薄膜上转换的可见光无上述反应。结论:UCNPs结合980 nm NIR用于光遗传学技术可成功夺获心肌，利用NIR的组织穿透性优势，有可能为心脏光遗传学研究提供新的实施策略。