目的:探讨间断清除衰老细胞对规模化长期培养中牙髓干细胞（DPSC）增殖和分化功能的影响，探索维持体外培养DPSC年轻状态的方法。方法:从四川大学华西口腔医院口腔颌面外科提供的因正畸或阻生拔除的健康恒牙中提取人DPSC，模拟DPSC体外规模化长期培养过程，并对年轻DPSC（第5代，P5）、衰老DPSC（第25代，P25）进行细胞衰老β-半乳糖苷酶染色、集落形成实验、成骨分化诱导茜素染色实验。利用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色比较5种衰老清除药物［那维克拉（ABT-263）、姜黄素、达沙替尼、非瑟酮、槲皮素］的清除效率，选择清除效率最高的药物进行后续实验。选取衰老细胞占比开始显著增多的代数，给予间隔3代、累计3次的衰老清除药物处理，对对照组和药物处理组细胞进行荧光细胞衰老β-半乳糖苷酶染色、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、集落形成实验、细胞划痕实验、成骨诱导茜素红染色实验。体内验证使用裸鼠皮下异位成骨实验，对移植物进行HE染色、免疫组织化学染色。结果:衰老细胞占比随培养周期延长而增加，相比年轻DPSC，衰老DPSC的增殖和成骨分化能力显著减退（ P<0.05）。与年轻DPSC相比，衰老DPSC衰老相关蛋白p21、p16 INK4a、白细胞介素6（IL-6）mRNA及增殖相关蛋白Ki67 mRNA表达量均发生显著改变（ P<0.001）。5种衰老清除药物中，ABT-263衰老细胞占比最少。培养过程中间断使用ABT-263后，药物处理组衰老细胞占比［（6.72±2.34）%］显著小于对照组［（31.82±0.57）%］（ P<0.001）；RT-qPCR证实，药物处理组p21、p16 INK4a、IL-6 mRNA表达量均显著小于对照组（ P<0.05），Ki67 mRNA表达量显著大于对照组（ P<0.01）。药物处理组的细胞愈合能力、成骨分化能力均显著大于对照组（ P<0.05）。体内实验结果显示，药物处理组DPSC的移植体内后相对新生骨质面积［（2.36±0.48）%］显著大于对照组［（1.00±0.46）%］（ P<0.05）。 结论:ABT-263可有效清除规模化长期培养DPSC的衰老细胞，培养过程中不断给予的ABT-263处理可维持规模化长期培养DPSC的体内及体外增殖、分化功能。

目的:探讨预防性使用非瑟酮(Fisetin)对急性前列腺损伤大鼠的保护作用及机制。方法:4～6周龄成年雄性Wistar大鼠通过对大鼠前列腺左、右腹侧叶各注射2针3%角叉菜胶生理盐水溶液，每针50 μl，共注射200 μl的方法，构建急性前列腺损伤大鼠模型。将36只大鼠采用随机数字表法分为6组(每组6只)，假手术(Sham)组、模型组、Fisetin低剂量组(25 mg/kg)、中剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg)、阳性药物组(普乐安片1.08 g/kg)，Fisetin治疗组及阳性药物组分别在造模前3 d每天1次，造模当天及造模后3 d每天1次(共7次)进行药物灌胃治疗。Sham组和模型组给予相同剂量的生理盐水，在注射角叉菜胶后3 d后处死大鼠，收集前列腺组织，通过苏木精-伊红(HE)染色分析每组大鼠前列腺组织病理学变化；酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光定量(RT-qPCR)、免疫组织化学法(IHC)分析炎性因子表达，蛋白质印迹法(Western blot)检测炎性因子及Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)与磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)的蛋白表达水平。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 t检验。 结果:模型组大鼠前列腺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白表达水平明显高于Sham组、Fisetin高剂量组和阳性药物组[IL-6：(245.10±7.73) pg/ml比(77.65±6.28)、(191.10±10.20)、(197.80±9.31) pg/ml， t＝6.632、4.237、3.924， P<0.05；0.90±0.05比0.61±0.05、0.36±0.08、0.31±0.07， t＝4.218、5.918、6.684， P<0.05；IL-1β：(55.59±4.06) pg/ml比(19.32±2.68)、(40.32±2.75)、(40.22±2.06) pg/ml， t＝3.453、3.126、3.385， P<0.05；1.07±0.08比0.66±0.02、0.46±0.05、0.37±0.06， t＝5.253、6.951、7.018， P<0.05；TNF-α：(188.40±14.36) pg/ml比(45.52±7.54)、(125.50±5.92)、(118.60±14.89) pg/ml， t＝7.158、4.135、3.372， P<0.05；0.84±0.06比0.53±0.05、0.44±0.04、0.40±0.02， t＝4.824、5.827、6.785， P<0.05]，差异有统计学意义。模型组大鼠前列腺组织中TLR-4、NF-κB/p-NF-κB水平明显高于Sham组、Fisetin高剂量组和阳性药物组(TLR-4：0.87±0.04比0.12±0.01、0.30±0.03、0.44±0.04， t＝7.453、11.236、7.953， P<0.05；NF-κB/p-NF-κB：1.38±0.04比1.01±0.04、0.50±0.04、0.42±0.05， t＝8.582、16.639、16.328， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:Fisetin可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻前列腺损伤大鼠的炎症水平，进而改善前列腺病变。

目的:探讨非瑟酮抑制吗啡诱导的小鼠小胶质细胞BV2活化和炎症的机制.方法:通过吗啡干预BV2细胞构建细胞模型,将细胞随机分为6组:对照组、吗啡组、吗啡+2 μmol/L非瑟酮组、吗啡+4 μmol/L非瑟酮组、吗啡+8 μmol/L非瑟酮组和吗啡+10 μmol/L米诺环素组,实验重复3次.CCK-8法检测细胞活力;ELISA试剂盒检测细胞上清液中炎症因子水平;Western blot检测炎症相关蛋白及BV2细胞活化标志物表达水平;RT-qPCR和Western blot检测G蛋白偶联受体35(GPR35)的表达;BV2细胞转染GPR35干扰质粒验证非瑟酮是否通过调控GPR35抑制吗啡诱导的BV2细胞活化和炎症反应.结果:与对照组相比,不同剂量非瑟酮单独处理后BV2细胞活力均无显著差异;吗啡组细胞活力升高,炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6]、环加氧酶2(Cox-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达增加,BV2细胞活化标志物离子钙结合接头分子1(Iba-1)和CD11b表达上调(P<0.05).与吗啡组相比,吗啡+非瑟酮组和吗啡+米诺环素组细胞活力降低,炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、Cox-2和iNOS蛋白表达减少,BV2细胞活化标志物Iba-1和CD11b表达下调(P<0.05).RT-qPCR和Western blot结果显示,非瑟酮剂量依赖性地增加吗啡诱导的BV2细胞中GPR35的表达(P<0.05).干扰GPR35逆转非瑟酮对吗啡诱导的BV2细胞活化和炎症反应的抑制作用.结论:非瑟酮可能通过上调GPR35抑制吗啡诱导的小鼠小胶质细胞BV2活化和炎症.

非瑟酮(3,3'4'7-4羟基黄酮)是植物黄酮醇,是一种膳食类黄酮,存在于各种水果(草莓、苹果、芒果、柿子、猕猴桃和葡萄),蔬菜(西红柿、洋葱、黄瓜),坚果和葡萄酒中,在草莓、苹果、柿子中发现非瑟酮的含量最高.据估计,人体平均每日的非瑟酮摄人量是0.4 mg.非瑟酮具有强大的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降糖、神经保护以及心血管等多脏器保护作用.本文就非瑟酮的理化性质和药理作用等研究进展作一综述,为非瑟酮的进一步开发、现代研究和临床应用提供依据.

活性氧(reactive oxygen species,ROS)在非酒精性脂肪肝、心血管疾病、癌症、糖尿病等疾病发生发展的过程中具有重要作用.HepG2细胞是评价抗氧化剂对活细胞氧化损伤保护作用的常用细胞模型.为了探讨非瑟酮(fisetin)对H2O2诱导细胞内ROS的清除作用及其机制,将HepG2细胞随机分为空白对照组(control)、溶剂对照组(solvent control)、H2O2模型组(H2O2 model group)、fisetin干预组(fisetin+H2O2)、fisetin单独处理组(fisetin),检测不同干预组细胞存活率大小及细胞内ROS水平,同时检测核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor2,Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)及Ⅱ相酶血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1,HO-Ⅰ)、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)、谷氨酰半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifer subunit,GCLM)、醌氧化还原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表达.此外,通过构建Nrf2敲低细胞系,进一步明确Nrf2在fisetin清除ROS过程中的作用.研究发现,与H2O2模型组相比,fisetin干预组细胞存活率显著上升;fisetin可抑制由H2O2引起的HepG2细胞内ROS的增加,上调Nrt2、HO-1蛋白表达,并下调Keap1蛋白表达;Nrf2稳定敲低后,细胞内ROS水平增加.实验结果表明,fisetin可能通过激活Keap 1/Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)通路诱导HO-1的表达,从而在抗氧化损伤过程中发挥细胞保护作用.

目的 探讨非瑟酮(Fis)对高糖高脂诱导的小鼠脑微血管内皮细胞(BEND3)损伤的改善作用及其机制.方法 高糖高脂诱导BEND3损伤,建立体外糖尿病BEND3损伤模型,将细胞分为正常对照组(Con,低糖DMEM完全培养基)、25 mmol/L葡萄糖(HG)+200 μmol/L棕榈酸(PA)模型组(HG+PA)、HG+PA+1 μmol/L Fis组(HG+PA+1Fis)、HG+PA+5 μmol/L Fis组(HG+PA+5Fis)、HG+PA+10 μmol/L Fis组(HG+PA+10Fis)、HG+PA+20 μmol/L Fis组(HG+PA+20Fis).CCK-8检测BEND3细胞存活率,筛选最佳Fis浓度;乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞毒性;ELISA法检测细胞活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、VEGF、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)含量.结果 与Con组比较,HG+PA组细胞存活率降低,LDH含量升高(P＜0.05);与HG+PA组比较,HG+PA+20Fis组细胞存活率升高,LDH含量降低(P＜0.05).与Con组比较,HG+PA组ROS、NO、iNOS、VEGF、MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量升高(P＜0.05);与HG+PA组比较,HG+PA+20Fis组ROS、NO、iNOS、VEGF、MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达降低(P＜0.05).结论 Fis可改善糖尿病BEND3损伤,可能与抑制细胞内源性ROS及相关氧化因子的产生有关.

目的:运用网络药理学方法,筛选止痛如神汤治疗功能性肛门直肠痛的作用靶点,探究其作用机制.方法:通过中药系统药理数据库(TCMSP)检索止痛如神汤10味中药的所有化学成分并筛选作用靶点,通过GeneCards、OMIM数据库查询功能性肛门直肠痛的疾病靶点;利用R语言筛选药物和疾病的交集靶点,借助String数据库构建靶点蛋白互作网络;通过Cytoscape 3.7.0软件构建止痛如神汤化学成分-靶点-疾病网络;利用R语言对靶基因进行GO功能分析和KEGG通路分析.结果:筛选出止痛如神汤中4个主要化学成分槲皮素、汉黄芩素、非瑟酮、山奈酚,作用于疾病的4个关键靶点ESR1、NOS2、PGR、CHRM3,GO富集分析中获得分子功能条目66个,生物过程条目1040个,细胞组分条目26个,KEGG通路富集显示止痛如神汤通过调控糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、膀胱癌、雌激素信号通路、HIF-1信号通路等对功能性肛门直肠痛发挥治疗作用.结论:止痛如神汤治疗功能性肛门直肠痛可能与其多成分作用于多靶点、影响多个信号通路有关,为进一步研究活性成分和作用机制提供理论依据.

目的 探讨非瑟酮(fisetin)对肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)小鼠肝细胞凋亡的影响.方法 将18只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术(SO)组、HIRI组和HIRI+fisetin组,每组6只.HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠夹闭肝左叶和肝中叶的门静脉及肝动脉建立HIRI模型,SO组小鼠仅进行开腹和肝门游离手术.造模前1 h,HIRI+fisetin组小鼠经腹腔注射非瑟酮50 mg·kg-1,SO组和HIRI组小鼠经腹腔注射等体积的二甲基亚砜.采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平,Western blot法检测小鼠肝组织中血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记法检测小鼠肝细胞凋亡.将对数生长期AML-12细胞分为对照组、缺氧复氧(HR)组和HR+fisetin组,对照组AML-12细胞正常培养,HR组和HR+fisetin组AML-12细胞制备HR模型,HR+fisetin组AML-12细胞在HR处理前1 h给予20μmol·L-1的非瑟酮预处理.采用细胞计数试剂盒检测AML-12细胞存活率,流式细胞术检测AML-12细胞凋亡.结果 HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠血清ALT、AST水平显著高于SO组(P<0.05),HIRI+fisetin组小鼠血清ALT、AST水平显著低于HIRI组(P<0.05).SO组、HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量分别为1.03±0.16、1.77±0.25、3.24±0.72,HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量显著高于SO组(P<0.05),HIRI+fisetin组小鼠肝组织中HO-1蛋白相对表达量显著高于HIRI组(P<0.05).SO组、HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率分别为(4.10±0.14)％、(31.29±1.01)％和(14.41±0.91)％,HIRI组和HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率显著高于SO组(P<0.05),HIRI+fisetin组小鼠肝细胞凋亡率显著低于HIRI组(P<0.05).对照组、HR组和HR+fisetin组AML-12细胞存活率分别为(98.73±1.56)％、(42.73±3.94)％、(86.43±5.17)％,HR组AML-12细胞存活率显著低于对照组(P<0.05),HR+fisetin组AML-12细胞存活率显著高于HR组(P<0.05);HR+fisetin组与对照组AML-12细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05).对照组、HR组和HR+fisetin组AML-12细胞凋亡率分别为(6.83±0.21)％、(24.44±0.63)％、(7.63±0.52)％,HR组AML-12细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),HR+fisetin组AML-12细胞凋亡率显著低于HR组(P<0.05),HR+fisetin组与对照组AML-12细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 非瑟酮预处理能够减轻小鼠HIRI,其机制可能与HO-1蛋白高表达、抑制肝细胞凋亡有关.

目的 探讨非瑟酮(Fisetin)对阿霉素(Doxorubicin,DOX)诱导的人肺动脉内皮细胞(HPAEC)衰老的影响及其相关机制.方法 使用不同浓度的DOX(0.1、0.25、0.5、1μmol/L)诱导HPAEC衰老,通过CCK8法检测细胞增殖活性,Western blot法检测衰老相关蛋白P53、P21表达.随后用不同浓度的Fisetin作用于HPAEC,分别于0、24、48和72 h检测Fisetin对HPAEC细胞增殖的影响,流式细胞术检测Fisetin对细胞周期的影响,利用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)对衰老细胞进行染色并计数,活性氧(ROS)试剂盒检测Fisetin对HPAEC活性氧(ROS)产生的影响,West-ern blot法检测衰老相关蛋白、Nrf2和MAPK信号蛋白的表达情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分泌的细胞因子浓度,CCK8法检测Fisetin预处理的HPAEC培养上清对人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)增殖的影响.结果 当Fisetin浓度在20μmol/L以下时,HPAEC增殖活性在24、48、72 h没有明显降低,差异无统计学意义(P>0.05);流式细胞术检测发现DOX刺激后,90％ 以上的HPAEC被阻滞在DNA合成前期(G0/G1期),而Fisetin(5、10、20μmol/L)处理组细胞周期在DNA合成期(S期)分别占40％、50％ 及55％,呈浓度依赖性上升,差异具有统计学意义(P<0.01).Western blot证实DOX刺激后,HPAEC中衰老相关蛋白P21表达增加,而随着Fisetin作用浓度的增加,P21表达逐渐下降(P<0.05).SA-β-gal衰老染色和ROS染色证实DOX干预后,衰老细胞的数量明显增加,ROS的产生量也增加;而Fisetin处理后,衰老细胞的数量逐渐减少,ROS的产生量也减少.Fisetin可增加HO-1、p-P38的表达,促进Nrf2核转移,沉默HO-1和抑制p-P38表达均可减弱Fisetin对P21的抑制作用.DOX刺激后细胞衰老相关分泌表型(SASP)的细胞因子表达不断升高,而不同浓度的Fisetin(5、10、20μmol/L)干预后,SASP细胞因子的表达量下降.CCK8实验证实,Fisetin预处理的HPAEC培养上清对HPASMC增殖有抑制作用.结论 Fisetin可通过Nrf2/HO-1和MAPK信号通路抑制DOX诱导的HPAEC衰老,并能够抑制HPASMC增殖,从而抑制肺动脉重塑.

目的 探讨持续性房颤中药用药规律.方法 通过DisGeNET数据库和GeneCards数据库搜索持续性房颤相关靶点,运用Venn图去除重复疾病靶点,之后采用DAVID、KEGG数据库进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析.以OB≥30％,DL≥0.18为筛选条件,于TCMSP数据库筛选持续性房颤潜在靶点相关化合物和相关中药,并以此构建靶点-化合物-中药可视化网络.参考中国药典2020版和中药学第九版,收集中药四气五味、归经等相关信息,运用统计方法进行分析,获取持续性房颤的中药用药规律.结果 获得持续性房颤相关基因靶点21个,与此同时,在TCMSP数据库中匹配到相关化合物566个,4613个相关中药,去除重复值,总计中药316味,如甘草、钩藤、延胡索等.其中槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、木犀草素、非瑟酮、汉黄芩素、鸢尾酮等预测为主要干预持续性房颤的化合物.中药的四气五味、归经统计结果显示,相关中药性味以苦寒为主,多归肝经.结论 本研究探讨了治疗持续性房颤的相关化合物,分析了中药用药规律,为治疗持续性房颤的临床用药提供参考,对推动新药研发具有一定的价值.