目的 采用超高效液相色谱-串联质谱法测定再造丸中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ的含量.方法 采用Waters Acquity BEH UPLC C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm,1.7 μm),以甲醇-0.1％甲酸溶液(含5 mmol·L-1甲酸铵)为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min-1,采用电喷雾离子源,正离子模式下,多反应监测模式下,用外标法定量.结果 4种马兜铃酸类成分在各自浓度范围内的线性关系良好(r＞0.9990),平均加样回收率为88.4％～102.5％,RSD均小于5％.结论 所用方法的专属性好、灵敏度高、结果准确,可为再造丸的质量控制提供参考.

目的:建立超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定追风透骨丸中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ和马兜铃内酰胺Ⅰ的含量.方法:采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);以乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmo·l L-1甲酸铵)为流动相梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1,用电喷雾离子源,在多反应监测模式下采用外标法测定.结果:4个成分在2～250 ng·mL-1线性关系良好,r均大于0.999,在20 ng·mL-1添加水平的平均回收率分别为104.2%、75.7%、112.0%、105.4%,RSD为2.8%～6.1%,方法定量限为 0.002～0.100 μg·g-1.7 批样品中均未检出马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ,马兜铃酸Ⅰ检出量为 0.09～0.41 μg·g-1,马兜铃内酰胺Ⅰ检出量为 0.62～1.30 μg·g-1.结论:该方法专属性好、灵敏度高、结果准确,可为追风透骨丸中马兜铃酸的质量控制提供参考.

目的 考察3种马兜铃酸和2种马兜铃内酰胺在《中华人民共和国药典》(简称"《中国药典》")收载的北细辛、华细辛及汉城细辛不同部位中的分布和含量.方法 采用HPLC-DAD测定北细辛、汉城细辛和华细辛的果、叶、根及根茎中马兜铃酸Ⅰ等3种马兜铃酸和2种马兜铃内酰胺的含量,并以LC-MS检测细辛根及根茎中马兜铃酸I是否存在.结果 通过对30份细辛果、97份细辛叶和97份细辛根及根茎样品检测的结果表明:3种细辛的果中均分布较高含量的马兜铃酸Ⅰ(0.095-2.200 mg·g-1)、9-羟基马兜铃酸Ⅰ(0.012-0.103 mg·g-1)、马兜铃内酰胺Ⅰ(0.025-0.147 mg·g-1)和马兜铃内酰胺Ⅱ(0.120-0.144 mg·g-1),未检测到马兜铃酸Ⅱ;3种细辛的叶中(除了2份样品)均分布有马兜铃酸Ⅰ,含量为0.010-0.140 mg·g-1,其它4种成分未检测到;HPLC法在细辛根及根茎的97份样品中均未检测到3种马兜铃酸和2种马兜铃内酰胺中的任何1种,但经过灵敏度更高的LC-MS检验,所测定的4份细辛根及根茎样品中均分布极微量的马兜铃酸Ⅰ(0.4-2.4μg·g-1).结论 本研究通过检测大量的细辛采集样品和多省市的细辛商品,报道了3种马兜铃酸和2种马兜铃内酰胺在《中国药典》收载细辛不同部位中的分布和含量情况,为《中国药典》(2005年版)把细辛药用部位由"全草"修订为"根及根茎"而保证细辛的临床用药安全提供了科学数据的支撑.

目的 运用高效液相串联四级杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF/MS)法分析马兜铃水煎剂中的化学成分,为后续马兜铃的毒性研究提供借鉴.方法 在总结马兜铃酸I和马兜铃内酰胺I质谱裂解规律的基础上,通过高分辨质谱提供的准确分子量及二级碎片离子信息,推测马兜铃药材中可能含有的化学成分,并对马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类成分进行半定量分析.结果 从马兜铃水煎剂中推测出18个化学成分,包括6个马兜铃酸类成分和7个马兜铃内酰胺类成分,其中马兜铃酸类成分的总峰面积是马兜铃内酰胺类成分总峰面积的1.23倍.结论 尽管目前公认马兜铃酸I和马兜铃酸Ⅱ是马兜铃的毒性化学基础,但是考虑到马兜铃中还含有很多其它马兜铃酸类成分以及马兜铃内酰胺类成分,这些成分也可能导致马兜铃药材的肝肾毒性,有待进一步深入的研究.这是首次用高分辨质谱分析鉴定马兜铃水煎剂中的马兜铃酸类和马兜铃内酰胺类成分,可为下一步马兜铃水煎剂成分的植化分离和毒性筛选提供借鉴.

采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)测定小鼠肝肾中4种马兜铃酸-DNA加合物的含量,并对给药后不同时间小鼠肝肾中马兜铃酸-DNA加合物的含量变化进行监测.选用资生堂Capcellpak AQ C18色谱柱(3mm× 100mm,3μm),以0.2％乙酸-5 mmol·L-1乙酸铵为水相,甲醇为有机相进行梯度洗脱,采用电喷雾离子源(ESI),正离子模式扫描,在多反应监测模式(MRM)下测定马兜铃酸Ⅰ/Ⅱ分别与脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷结合形成的马兜铃酸-DNA加合物.通过分析Balb/c小鼠灌胃给药关木通提取物后60d内肝肾样品中马兜铃酸-DNA加合物的相对含量发现,肾脏中的4种马兜铃酸-DNA加合物含量均明显高于肝脏,每1×106个正常脱氧核苷中大约有15.87个加合物,是肝脏的4.5～7.5倍,部分加合物在给药后第30天仍能检测到.肝脏中的加合物在给药后第1天含量最高,在第7～ 14天又出现了二次达峰的现象.该结果说明马兜铃酸-DNA加合物在体内消除困难,对研究马兜铃酸肝肾损伤机制具有重要意义.

马兜铃酸是一类硝基菲类羧酸,广泛分布于马兜铃科植物中,主要化合物包括马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4种.长期服用含马兜铃酸药物可导致马兜铃酸肾病,诱发泌尿系统肿瘤.马兜铃酸的活性代谢产物可与DNA形成加合物,诱导基因发生A-T颠换突变,该突变常被作为马兜铃酸特征性标签.2017年Sci Transl Med报道指出,马兜铃酸及其衍生物与包括中国台湾在内的亚洲地区肝癌发生相关,认为应将避免使用马兜铃酸列为肝癌的一级预防策略.该报道引发了国内外研究者对于马兜铃酸是否具有肝脏致癌性的一系列探讨,本文即针对这一热点问题进行分析,主要讨论已有报道中马兜铃酸肝脏致癌性的争议点,科学客观地评价马兜铃酸与中国人群肝癌发生的关系,同时探讨含马兜铃酸药物安全使用仍需解决的问题,提出药物安全使用的一些思考.

目的:探讨黄芪甲苷对马兜铃酸诱导的RAW264.7细胞向M1型极化的影响,并初步探索其可能的作用机制.方法:分别采用马兜铃酸和脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞24h,伴或不伴黄芪甲苷进行药物干预处理.采用细胞计数检测试剂盒-8(CCK8)检测细胞活性变化,流式细胞仪检测巨噬细胞分型,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌量.反转录实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测RAW264.7细胞IL-6、TNF-α mRNA表达.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测RAW264.7细胞p-p38和p38 MAPK蛋白表达水平.结果:CCK8结果提示黄芪甲苷在5～50 μg/mL浓度范围对RAW264.7巨噬细胞无明显毒性,本研究选取10μg/mL作为实验干预浓度.黄芪甲苷能够显著改善马兜铃酸诱导的巨噬细胞活性(P＜0.05),同时减少Ⅱ-6和TNF-α的分泌水平和mRNA表达水平(均P＜0.05),抑制马兜铃酸和LPS诱导的M1/M2巨噬细胞比例(P＜0.05).黄芪甲苷可部分抑制马兜铃酸诱导的巨噬细胞p38 MAPK磷酸化水平(P＜0.05).结论:黄芪甲苷可减少巨噬细胞M1型极化,降低炎症因子IL-6和TNF-α水平,减少巨噬细胞的活性,从而起到减缓马兜铃酸肾损害的作用,其作用机制可能与部分抑制p38 MAPK信号活性有关.

目的:建立朱砂莲块根中马兜铃酸类成分的定性与定量测定方法.方法:采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法(UPLC-QTOF-MS/MS)对朱砂莲块根进行定性与定量分析,检测条件ACQUITY UPLC-BEH C18色谱柱(2.1 mm× 100 mm,1.7 μm),以0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱(0～1 min,10％B;1～9 min,10％～30％B;9～11 min,30％～50％B;11～15 min,50％～90％B),流速0.45mL·min-1,柱温35℃,检测波长250 nm;电喷雾电离源(ESI),正离子模式检测.同时,建立了 21批朱砂莲样品中马兜铃酸类成分的UPLC指纹图谱,根据指纹图谱分析结果,测定了不同产地和不同采收期朱砂莲样品中5个马兜铃酸类成分的含量.结果:结合文献信息和质谱数据,一共鉴定了朱砂莲中17个马兜铃酸类化合物,包括8个马兜铃酸,7个马兜铃内酰胺和2个4,5-二羰基阿朴菲类生物碱.UPLC指纹图谱中指认了 10个共有峰,分别为朱砂莲苷,马兜铃内酰胺Ⅰ a-N-β-D-葡萄糖苷,马兜铃酸Ⅳa-O-β-D-葡萄糖苷,马兜铃内酰胺Ⅲa-N-β-D-葡萄糖苷,马兜铃内酰胺Ⅰ-N-β-D-葡萄糖苷,马兜铃酸C,马兜铃酸D,马兜铃酸Ⅱ,马兜铃内酰胺Ⅰ,马兜铃酸Ⅰ.定量分析结果显示,马兜铃酸Ⅰ,Ⅱ,C,D及马兜铃内酰胺Ⅰ在线性范围内呈良好的线性关系,精密度、稳定性、重复性试验的RSD均＜3.0％,加样回收率范围在97.06％～101.84％(RSD＜3.0％).21批朱砂莲中马兜铃酸Ⅰ,马兜铃酸Ⅱ,马兜铃酸C,马兜铃酸D,马兜铃内酰胺Ⅰ的质量分数范围分别为0.938 6～3.567 5,1.377 6～3.688 1,0.056 3～0.527 7,0.108 8～0.305 5,0.021 0～0.081 7 mg·g-1.结论:朱砂莲中马兜铃酸类成分的含量存在一定差异,马兜铃酸Ⅰ和Ⅱ的含量要高于其他马兜铃酸类成分.建立的分析方法快速简便、准确可靠,可为朱砂莲的质量控制与评价提供参考.

目的:对鱼腥草(Houttuynia cordata)进行初步肝毒性鉴定和化合物分离鉴定.方法:运用MTT法测定鱼腥草不同极性段萃取物对人胚胎肝细胞存活率的影响,采用柱色谱法进行化学成分分离,结合核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR),质谱(Mass spectrometry,MS)对分离得到的化合物进行结构鉴定.结果:二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇部位以100～500 mg/L等梯度浓度处理人胚胎肝细胞,实验结果显示,100 mg/L二氯甲烷部位处理后人胚胎肝细胞存活率仅为(66.3±1.7)％,浓度增加至500 mg/L后其存活率下降约20％;乙酸乙酯部位以同样方式处理,随着浓度增加至500 mg/L,其存活率从100％下降至80％左右;正丁醇部位无明显影响.从中分离鉴定了4个化合物,分别为马兜铃内酰胺BⅡ(aristo-lolactam BⅡ,化合物1)、胡椒内酰胺A(piperolactam A,化合物2)、山柰酚(kaempferol,化合物3)、5-O-咖啡酰基莽草酸(5-O-caffeoylshikimic acid,化合物4),其中5-O-咖啡酰基莽草酸为首次从该植物中分离得到.结论:二氯甲烷、乙酸乙酯部位随着处理浓度增加,人胚胎肝细胞存活率逐渐下降并呈线性关系,可初步认为鱼腥草低极性段萃取物含有毒性物质.

探究并明确含马兜铃酸类毒性物质药材中马兜铃酸类成分的种类、数量及含量,以进一步确保此类药材及其相关产品的使用安全.本研究选取了朱砂莲、杜衡、关木通、马兜铃、青木香、天仙藤、寻骨风、广防己和细辛9种含马兜铃酸类毒性物质的中药材,采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪(HPLC-Q-TOF-MS)结合高效液相色谱-二极管阵列检测定.性分析9种药材中的马兜铃酸类成分.选用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(250 mmx 4.6 mm,5 μm)分离,以乙腈-0.2％乙酸水为流动相,梯度洗脱,质谱使用ESI正离子模式,分析马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅳa、Ⅶa,马兜铃内酰胺Ⅰ、Ⅱ 7个对照品的质谱电离规律,并利用此规律对9种药材样品中筛选出的紫外光谱图与7个对照品光谱相似的成分进行结构解析.应用高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)对鉴定出的马兜铃酸类成分采用外标法进行定量分析,检测波长为254 nm.结果显示:从9种药材中共筛选和鉴定出22个马兜铃酸类成分,包括11个马兜铃酸和11个马兜铃内酰胺.马兜铃酸类成分的种类在朱砂莲和青木香药材中最多,有15种,其次为马兜铃和关木通,为14种,成分的总量在朱砂莲和关木通中最高,在8.91～13.40 mg·g-1之间;在杜衡中最少,只有2种成分,总量在0.10 mg·g-1 以下.本研究系统性地筛选和明确了含马兜铃酸类毒性物质中药材中马兜铃酸类成分的种类、数量及含量,为后续此类药材的网络毒性分析和体外毒性实验,以及其中马兜铃酸类成分在质量标准中的安全性控制提供了有价值的依据.