人类基因组计划深刻地改变了人类对基因多样性以及疾病基因分子水平的理解.从第一个序列草案到个人基因组测序,都在测序技术的非凡进步下变为可能.随着高通量测序技术的不断迭代更新,其技术也不断地成熟与稳定.高通量测序技术在临床样本病原体鉴定、肿瘤检测、疾病诊断等领域的应用逐渐广泛,从而为精准医疗提供了更加高效的分析检测工具.

目的 基于实时细胞分析(real time cell analysis,RTCA)技术对中药挥发性组分的细胞毒性及抗人腺病毒3型(human adenovirus 3,HAdV-3)的作用进行毒/效整合分析,构建抗病毒药物高通量筛选的新策略.方法 采用RTCA技术动态监测不同接种密度的A549细胞48 h生长曲线及10倍梯度稀释的HAdV-3感染A549细胞生长曲线,获得A549细胞最佳接种密度及HAdV-3最佳稀释浓度用于后续实验.以利巴韦林为阳性对照,基于RTCA技术采用曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)方法对5种中药挥发性组分的细胞毒性及抗HAdV-3的作用进行毒/效整合分析,并与传统终点法数据处理进行对比.结果 终点法中艾叶、柴胡、薄荷、荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林对细胞的保护率分别为0.73％、12.50％、20.99％、44.50％、27.99％、51.50％和 82.70％;AUC 法中艾叶、柴胡、薄荷的选择性指数(Selective In-dex,SI)为负数,分别为-0.57、-0.21和-0.08.荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林的SI值分别为0.14、0.40、0.72和5.33.以利巴韦林的抗病毒活性为参照,终点法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的62.27％、33.85％和53.81％;AUC法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的13.51％、7.50％和2.63％.结论 传统终点法与研究采用的AUC法计算结果有较大的差异.传统的抗病毒活性筛选研究多采用终点法检测受试药物对病毒感染细胞的保护作用,无法反映整个感染周期的变化,缺乏细胞毒的数据也会对结果的判断产生偏差.研究提示基于RTCA技术对中药挥发性组分开展抗HAdV-3的毒/效整合评价,采用AUC方法计算药物的选择性指数作为高通量筛选新策略,能快速、精准地判断受试药物的抗病毒活性,具有准确性高、重复性好的优势.

目的:对不同患龋儿童唾液进行高通量测序并分析低龄儿童龋(early childhood caries,ECC)的影响因素,为探究ECC与菌群的相关性及ECC综合诊断模型的建立提供依据.方法:对儿童口腔检查,根据结果分为无龋(caries free,CF)组、ECC组和重度低龄儿童龋(severe early childhood caries,SECC)组,采取问卷调查方法探究ECC的影响因素;同时对儿童唾液进行高通量测序,并拟采用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)建立基于以上结果的疾病诊断模型.结果:不同患龋儿童的微生物群落组成存在显著统计学差异(P＜0.05).在前15个细菌属中,韦荣菌属(Veillonella)、纤毛菌属(Leptotrichia)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)丰度水平的差异在3组间具有统计学意义(P＜0.05).Veillonella和Leptotrichia为ECC组的标志物种,Alloprevotella在SECC组中显著富集.戒断奶瓶喂养的年龄、Veillonella、Leptotrichia、Alloprevotella联合应用筛选高患龋风险儿童的ROC曲线下面积为0.754.结论:Veillonella、Leptotrichia、Alloprevotella可能为患龋儿童唾液中潜在的致龋菌.戒断奶瓶喂养的年龄、Veillonella、Leptotrichia、Alloprevotella联合检测对筛选高患龋儿童具有诊断价值.

目的 探讨基于高通量测序的表达差异microRNA(miRNA)在左心室心肌肥厚(left ventricular hypertrophy,LVH)患者中的表达水平及临床意义,并揭示可能的调控作用机制.方法 分别在 4 例 LVH患者和 4 例健康志愿者血浆样本中进行miRNA测序,并在 25 例健康志愿者和 35 例LVH患者血浆样本中进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.通过预测差异性miRNA的靶基因、基因本体富集分析、京都基因与基因组百科全书信号通路分析、构建蛋白质-蛋白质相互作用网络等生物信息学分别进行分析,并通过ROC曲线下面积(AUCROC)评估miRNA对LVH的诊断价值.结果 共鉴定出 945 个差异表达的miRNA,其中 1 个显著上调,9 个显著下调.经 qRT-PCR 验证,hsa-miR-942-5p 和 hsa-miR-184 的表达水平显著下调;hsa-miR-942-5p的AUCROC为0.694 6,hsa-miR-184 的AUCROC为0.880 4.生物信息学分析显示,靶基因主要富集在细胞衰老、鞘脂代谢、TGF-β信号通路、p53、糖尿病代谢相关通路.结论 LVH患者血浆样本中hsa-miR-942-5p和hsa-miR-184 的表达水平显著降低,提示其具有良好的诊断潜力.

目的:筛选糖尿病肾病(DKD)小鼠肾脏组织中差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)、小RNA(miR-NA),构建lncRNA相关竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络.方法:选取 6 只BKS-db/m雄性小鼠为对照组,6 只BKS-db/db雄性小鼠为模型组,模型组构建DKD小鼠模型.处死小鼠后取肾脏组织进行高通量测序,利用DESeq软件筛选两组差异表达的lncRNA、miRNA,使用Miranda软件进行差异表达的miRNA靶基因预测.构建lncRNA相关ceRNA调控网络并进行GO功能富集分析以及KEGG信号通路富集分析.结果:共筛选出DKD小鼠差异表达的lncRNA 1 495 个、差异表达的miRNA 72 个.成功构建由MSTRG.7252.3、MSTRG.10465.2、MSTRG.16253.3等23 个lncRNA、23 个miRNA与2 个mRNA组成,与lncRNA相关的ceRNA网络.GO功能富集分析显示,该网络主要涉及生物学过程、细胞组成和分子功能;KEGG信号通路富集显示,主要与PPAR信号通路、造血细胞谱系、细胞黏附分子、TNF信号通路等有关.结论:成功构建DKD小鼠lncRNA相关的ceRNA调控网络.

目的 基于高通量测序技术探讨荔枝核总黄酮(TFL)对肝纤维化大鼠差异lncRNAs、mRNAs表达的影响及其生物学功能分析.方法 2021年4-7月于广西中医药大学实验动物中心进行实验,建立肝纤维化大鼠模型,将大鼠随机分为对照组(Control,n=6)、模型组(Model,n=7)和荔枝核总黄酮组(TFL,n=7),TFL组大鼠给予TFL 50 mg·kg-1·d-1干预6周.采用HE和Masson染色观察肝脏组织纤维化改变,ELISA法测定血清透明质酸酶(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ),RNA-seq高通量测序技术筛选Model和TFL组差异表达lncRNAs和mRNAs.cis方式预测差异表达lncRNAs靶基因,GO和KEGG对各差异表达lncRNAs靶基因和mRNAs进行生物学功能富集分析.结果 纤维化评分比较,Model组＞TFL组＞Control组(F=14.420,P＜0.001),大鼠血清 HA、LN、Ⅳ-C 和 PC Ⅲ 水平比较,Model 组＞TFL 组＞Control 组(F=47.055、74.655、177.328、54.445,P 均＜0.001).共筛选出Model组与TFL组差异表达lncRNAs 73个(上调43个,下调30个),Model组与TFL组差异表达mRNAs 261个(上调150个,下调111个),采用cis方式共预测到Model与TFL组24个靶基因;差异表达lncRNAs靶基因和mRNAs的生物学富集功能分析显示TFL通过参与昼夜节律、谷胱甘肽代谢泛醌、戊糖磷酸途径等信号通路发挥抗肝纤维化的作用.结论 TFL能够明显改善大鼠纤维化组织病理学形态,降低血清HA、Ⅳ-C、LN、PC-Ⅲ含量,其作用机制可能与调控特定差异lncRNAs和mRNAs表达,参与昼夜节律、谷胱甘肽代谢泛醌、戊糖磷酸途径等信号通路有关.

目的 了解云南省保山市育龄人群地中海贫血基因携带情况.方法 利用高通量测序技术对 874例样本进行α-地贫及β-地贫检测,统计分析人群分布特征.结果 874 例样本中检出地贫基因阳性样本251 例,地贫基因的人群阳性率为28.72%(251/874);α-地贫基因阳性样本140 例,阳性率为16.02%(140/874),以基因突变类型αα/-α3.7 为主;β-地贫阳性样本 95 例,阳性率为 10.87%(95/874),以基因型CD26 为主;αβ-复合型地贫基因阳性样本 16 例,阳性率为 1.83%(16/874);汉族人群和少数民族人群地贫携带差异性比较差异具有统计学意义(P<0.01).此外另检出 α-珠蛋白基因三联体阳性率为 1.49%(13/874),以基因型αααanti3.7 为主.结论 保山市是地贫高发地区,地中海贫血阳性率较高,最为常见的突变类型是αα/-α3.7 和CD26.研究对保山地区地贫防控、临床遗传咨询工作提供了一定的理论依据.

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业健康长久发展的重大威胁.原生生物是微生物家庭的重要一员,在维护植物健康中起着不可估量的作用.本研究分析了健康与患黄龙病柑橘根际土原生生物多样性和群落结构,探究了影响原生生物群落的关键土壤化学因子.结果表明,纤毛虫门(Ciliophora)、绿藻门(Chlorophyta)、丝足虫门(Cercozoa)是健康与患黄龙病柑橘根际土的优势类群.黄龙病的发生不仅造成根际土壤中原生生物群落多样性显著降低,还导致土壤化学指标中总氮、总磷、碱解氮、速效磷和有机质含量及pH值均有所降低.RDA分析表明,Protosteliida、硅藻门(Diatomea)、隐藻门(Cryptophyceae)和叶足亚门(Heterolobosea)与速效磷呈正相关;Protalveolata与碱解氮和pH呈正相关;丝足虫门、MAST-12、顶复门(Apicomplexa)和Schizoplasmodiida与各项化学指标均呈显著负相关.相关性分析表明,黄龙病菌与捕食型和光营养型原生生物呈显著负相关.总体而言,柑橘黄龙病菌侵染引发土壤化学特性变化,显著改变了根际区域原生生物的多样性与结构,土壤有机质、总氮和pH是影响原生生物结构的关键因子.本研究有助于了解患黄龙病对柑橘根际土原生生物群落结构、多样性和土壤化学性质的影响,为柑橘黄龙病的绿色防控提供参考.

[目的]利用线粒体基因组序列数据分析缘蝽科(Coreidae)亚科间的系统发育.[方法]使用高通量测序对4种缘蝽(纹须同缘蝽Honoeocerus striicornis、广腹同缘蝽H.dilatatus、宽棘缘蝽Cletus schmidti和褐莫缘蝽Molipteryx fuliginosa)进行低覆盖度全基因组测序;从获得的全基因组测序数据中重建线粒体基因组全序列;联合已经公布的缘蝽科3个亚科32个种的线粒体基因组序列(作为内群)以及蛛缘蝽科(Alydidae)中的3个种的线粒体基因组序列(作为外群),分别采用最大似然法和贝叶斯法重建缘蝽科亚科间的系统发育.[结果]纹须同缘蝽、广腹同缘蝽、宽棘缘蝽和褐莫缘蝽线粒体基因组(GenBank登录号:OR702557-OR702560)的长度分别为15 706,15 913,17 685和16 959 bp,新获得的这4种缘蝽线粒体基因组的基因排列方式与典型的昆虫线粒体基因组一致,没有基因重排等特殊的基因组织结构;此外,这4种缘蝽线粒体基因组的全基因组序列、蛋白质编码基因、rRNA基因和tRNA基因序列都具有较高的A+T含量(≥70％).最大似然法和贝叶斯法重建的缘蝽科系统发育树具有大体相同的拓扑结构;所有结果都支持缘蝽亚科(Coreinae)为单系群,缘蝽亚科与希缘蝽亚科(Hydarinae)互为姐妹群.[结论]本研究利用线粒体基因组数据重建了缘蝽科亚科间的系统发育,结果支持缘蝽亚科为单系群,缘蝽亚科与希缘蝽亚科互为姐妹群.本研究为进一步在系统发生框架内探讨缘蝽科的系统演化提供了线粒体系统发育基因组学数据.

为降低发酵成本,提高微生物采油效率,本研究开展了采油功能菌SQ6(鼠李糖脂产生菌)的开放式发酵探索研究.考察了菌株SQ6在常规发酵和开放式发酵方式不同温度下的生长、鼠李糖脂产量、表面张力及乳化指数等参数,采用液相色谱高分辨质谱联用仪分析了鼠李糖脂产物同系物组成,高通量测序分析了开放式发酵的细菌群落结构和杂菌率.结果表明:菌株SQ6最高生长温度是45℃,能够合成大量鼠李糖脂的最高温度是40℃;开放式发酵产量最高、杂菌率最低的发酵温度是37℃,鼠李糖脂产量达到7050.1 mg·L-1,仅比常规发酵的10513.2 mg·L-1降低了 33％,杂菌率最低,达到3.13％;针对SQ6菌株,高温发酵并没有更好的杂菌抑制效果并且降低了鼠李糖脂产量,发酵产物结构显示产物以单鼠李糖脂为主,占比达到96.1％.高浓度单鼠李糖脂的合成可能是中温条件下开放式发酵具有较好杂菌抑制率的主要原因.菌株SQ6是一株具有较大开放式发酵潜力的采油功能菌.