目的:观察银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，EGb)对鱼藤酮所致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)损伤的保护作用及机制。方法:将PC12细胞分为空白对照组、鱼藤酮模型组(0.5 μmol/L鱼藤酮)和EGb761组(0.5 μmol/L鱼藤酮＋100 mg/L EGb761)，按照分组给予药物干预后，采用JC-1探针检测各组细胞线粒体膜电位；美国海马细胞能量代谢分析仪检测线粒体能量代谢水平，Western blot检测半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)和裂解caspase-3(cleaved-caspase-3)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(posphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K，p-PI3K)、丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine-protein kinase，AKT)、磷酸化AKT(phosphorylated AKT，p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)的蛋白表达水平。使用SPSS 20.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验。结果:(1)3组细胞的线粒体膜电位差异有统计学意义( F＝34.89， P<0.05)，EGb761组细胞的线粒体膜电位显著高于鱼藤酮模型组[荧光强度比值：(1.30±0.16)，(0.81±0.15)]( P<0.05)。(2)3组细胞的基础呼吸水平、ATP产生能力、最大呼吸能力和呼吸储备能力均差异有统计学意义( F＝38.07，64.18，64.42，34.62，均 P<0.05)，EGb761组细胞的基础呼吸水平[(73.02±13.81)pmol/min]、ATP产生能力[(57.08±7.31)pmol/min]、最大呼吸能力[(177.70±17.14)pmol/min]和呼吸储备能力[(104.72±8.58)pmol/min]均显著高于鱼藤酮模型组[(33.69±3.91)pmol/min，(18.08±2.50)pmol/min，(113.12±13.24)pmol/min，(79.43±9.35)pmol/min](均 P<0.05)。(3)3组细胞的cleaved-caspase-3/caspase-3、p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均差异有统计学意义( F＝48.05，28.68，33.73，45.81，17.39，均 P<0.05)，EGb761组细胞的cleaved-caspase-3/caspase-3比值[(1.95±0.36)，(3.56±0.37)]和p-AMPK/AMPK比值[(1.49±0.19)，(2.25±0.27)]均显著低于鱼藤酮模型组(均 P<0.05)；p-PI3K/PI3K比值[(0.75±0.07)，(0.44±0.07)]、p-AKT/AKT比值[(0.74±0.06)，(0.36±0.09)]、p-mTOR/mTOR比值[(0.90±0.06)，(0.62±0.07)]均显著高于鱼藤酮模型组(均 P<0.05)。 结论:EGb761对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，其机制可能与其减弱了鱼藤酮对AMPK的激活和对PI3K/AKT/mTOR通路的抑制作用、增强了线粒体的能量代谢功能并抑制细胞凋亡有关。

Leber遗传性视神经病变（LHON）是一种由线粒体DNA突变引起的致盲性疾病，是研究线粒体异常的经典疾病模型，其主要突变位点为m11778G.A、m.3460G.A和m.14484T.C. LHON细胞模型主要通过淋巴母细胞、成纤维细胞、细胞杂种和诱导多能干细胞等产生，LHON动物模型主要通过鱼藤酮和 ND4突变体诱导小鼠产生。尽管对于LHON模型的研究已取得不错成果，但构建理想的实验模型仍存在较多困难，严重限制了对LHON发病机制和治疗药物的探索。详尽了解现有模型在LHON中的应用及特征，有助于完善实验设计和构建新模型。

目的:探讨miR-15b-5p参与PD中抑郁样行为发生的机制。方法:（1）将18只C57BL/6N小鼠按随机数字表法分为PD组、干预组及对照组，每组6只。PD组小鼠通过脑立体定位仪将0.25 mg/kg鱼藤酮注射至右侧纹状体以制备PD模型，干预组小鼠接受0.25 mg/kg鱼藤酮及miR-15b-5p抑制物慢病毒注射，对照组小鼠注射等体积PBS。4周后进行旷场实验及转棒实验评价小鼠的运动能力，进行糖水偏好实验及强迫游泳实验评价小鼠的抑郁样行为表现，然后提取小鼠黑质及纹状体中相关蛋白及miRNAs，进行Western blotting实验、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）实验以及免疫荧光染色实验检测相关指标[miR-15b-5p、酪氨酸羟化酶（TH）、脑源性神经营养因子（BDNF）、原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）、突触后密度蛋白95（PSD95）]。（2）将100 nmol/L miR-15b-5p模拟物/抑制物序列及各自阴性对照序列分别转染至6孔板上SH-SY5Y细胞中（分别命名为miR-15b-5p模拟物组、miR-15b-5p模拟物对照组及miR-15b-5p抑制物组、miR-15b-5p抑制物对照组），48 h后进行Western blotting实验及qRT-PCR实验，以检测BDNF、TrkB、PSD95蛋白及miR-15b-5p表达改变。（3）将100 ng BDNF 3'端非编码区（3'-UTR）野生型或突变型荧光素酶报告载体质粒以及100 nmol/L miR-15b-5p模拟物/抑制物序列及各自阴性对照序列共转染至24孔板上SH-SY5Y细胞中，得到相应8组细胞，48 h后进行荧光素酶报告载体活性检测实验，以检测各组细胞的荧光素酶活性。结果:（1）与对照组相比，PD组小鼠的运动速度明显减慢、落棒潜伏期明显缩短、糖水偏好百分比明显降低、不动时间明显增加；与PD组相比，干预组小鼠的运动速度明显提高、落棒潜伏期明显延长、糖水偏好百分比明显升高，不动时间明显减少；差异均有统计学意义（ P<0.05）。（2）与miR-15b-5p模拟物对照组比较，miR-15b-5p模拟物组细胞中miR-15b-5p表达明显升高，BDNF、TrkB、PSD95表达明显降低（100.00±5.75 vs. 66.79±5.90；100.00±5.95 vs. 84.46±5.77；100.00±7.02 vs. 80.43±3.25）；与miR-15b-5p抑制物对照组比较，miR-15b-5p抑制物组细胞中miR-15b-5p表达明显降低，BDNF、TrkB、PSD95表达明显升高（100.00±6.81 vs. 119.90±5.66；100.00±2.88 vs. 110.10±4.15；100.00±2.19 vs. 124.60±11.69）；差异均有统计学意义（ P<0.05）。与对照组相比，PD组小鼠黑质中miR-15b-5p表达明显增加，TH、BDNF、TrkB、PSD95表达明显降低（100.00±9.20 vs. 63.60±12.80；100.00±9.88 vs. 71.95±10.00；100.00±5.16 vs. 70.37±8.43；100.00±7.01 vs. 68.12±10.22），BDNF荧光强度明显降低（100.00±12.99 vs. 48.23±12.58）；与PD组相比，干预组小鼠黑质中miR-15b-5p表达明显降低，TH、BDNF、TrkB、PSD95表达明显升高（63.60±12.80 vs. 90.69±9.84；71.95±10.00 vs. 93.31±4.50；70.37±8.43 vs. 88.11±4.10；68.12±10.22 vs. 89.59±5.93），BDNF荧光强度明显升高（48.23±12.58 vs. 83.65±10.52）；差异均有统计学意义（ P<0.05）。（3）与BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p模拟物对照组比较，BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p模拟物组细胞中荧光素酶活性明显降低（100.00±5.07 vs. 90.59±1.75）；与BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p抑制物对照组比较，BDNF 3'-UTR野生型+miR-15b-5p抑制物组细胞中荧光素酶活性明显升高（100.00±5.08 vs. 152.20±31.87）；差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:miR-15b-5p通过下调BDNF/TrkB/PSD95表达参与PD中抑郁样行为发生。

目的:探讨耐力训练对帕金森病(Parkinson disease，PD)模型小鼠的保护作用以及通过AMPK/mTOR通路对自噬和外泌体途径的影响。方法:选用10周龄雄性C57BL/6小鼠32只，随机分为安静组、运动组、PD安静组及PD运动组，每组8只。运动组及PD运动组进行为期4周跑台耐力训练。训练结束后，PD安静组和PD运动组小鼠给予鱼藤酮(30 mg·kg -1·d -1)灌胃制备PD小鼠模型，1次/d，连续56 d；安静组和运动组小鼠给予等体积0.5%羧甲基纤维素盐溶液灌胃。灌胃结束后，运动组及PD运动组小鼠继续进行为期4周跑台耐力训练。训练结束后测定各组小鼠的行为学指标，免疫组化测定各组小鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)含量，Western blot测定各组血浆外泌体中α-突触核蛋白(α-syn)和外泌体表面标记蛋白CD9、CD63的表达及黑质微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)、α-syn、腺嘌呤核糖核苷酸依赖的蛋白激酶(adenine ribonucleotide dependent protein kinase，AMPK)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p-AMPK)、雷帕霉素的哺乳动物靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)的表达。应用SPSS 20.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD法。 结果:(1)四组小鼠转棒仪上停留时间差异有统计学意义( F＝ 2 618.20， P<0.01)。PD安静组小鼠转棒仪上停留时间[(110.34±8.20)s，(186.20±6.83)s， P<0.01]低于安静组，PD运动组小鼠转棒仪上停留时间[(160.56±8.30)s， P<0.01]高于PD安静组。(2)四组小鼠血浆外泌体标记蛋白CD9、CD63的表达差异无统计学意义( F＝1.57，1.26，均 P>0.05)。(3)四组小鼠血浆外泌体中α-syn的表达差异有统计学意义( F＝1 303.99， P<0.01)。PD安静组血浆外泌体中α-syn的表达[(180.57±8.20)，(100.00±0.00)， P<0.01]高于安静组，PD运动组血浆外泌体中α-syn的表达[(150.23±7.30)， P<0.01]低于PD安静组。(4)四组小鼠黑质TH阳性神经元数量差异有统计学意义( F＝447.09， P<0.01)。PD安静组小鼠黑质TH阳性神经元数量[(48.23±6.30)，(100.00±0.00)， P<0.01]少于安静组，PD运动组黑质TH阳性神经元数量[(68.62±8.20)， P<0.01]高于PD安静组。(5)Western blot结果显示，四组小鼠黑质α-syn、p-mTOR、p-AMPK、LC3-Ⅱ的表达差异有统计学意义( F＝753.62，361.48，261.95，248.07，均 P<0.01)。与安静组相比，PD安静组黑质α-syn的表达增加[(184.16±15.31)，(100.00±0.00)， P<0.01]，黑质p-mTOR的表达升高[(156.77±3.99)，(100.00±0.00)， P<0.01]，p-AMPK的表达降低[(70.65±8.43)，(100.00±0.00)， P<0.01]，黑质LC3-Ⅱ的表达降低[(72.25±7.86)，(100.00±0.00)， P<0.01]。与PD安静组相比，PD运动组黑质α-syn的表达降低[(158.23±9.30)， P<0.01]，黑质p-mTOR的表达降低[(123.61±16.86)， P<0.01]，p-AMPK的表达升高[(96.35±9.45)， P<0.01]，黑质LC3-Ⅱ的表达升高[(108.89±10.67)， P<0.01]。 结论:耐力训练通过AMPK/mTOR信号通路调节PD小鼠黑质神经细胞自噬和血浆外泌体的表达，保护小鼠中脑多巴胺能神经元，改善运动功能。

目的 探究单宁酸对缺氧诱导的H9c2心肌细胞的保护作用及机制.方法 体外培养大鼠H9c2细胞,利用条件培养基和缺氧小室建立缺氧诱导的H9c2细胞损伤模型,分为对照组、缺氧1组、低剂量单宁酸组(0.2 μmol单宁酸)和高剂量单宁酸组(0.8 μmol单宁酸).利用鱼藤酮进行功能回复实验,分为缺氧2组、缺氧+鱼藤酮抑制剂组(50 nmol鱼藤酮)、缺氧+鱼藤酮抑制剂+高剂量单宁酸组(50 nmol鱼藤酮+0.8 μmol单宁酸)、缺氧+高剂量单宁酸组(0.8 μmol单宁酸).细胞计数试剂盒8法和乳酸脱氢酶(LDH)评估细胞损伤;化学荧光法检测细胞内活性氧(ROS)、线粒体ROS;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)和白细胞介素1β(IL-1β)蛋白表达;酶联免疫吸附测定IL-1β分泌.结果 与对照组比较,缺氧1组H9c2细胞密度降低,贴壁不牢,细胞存活率显著降低,LDH 活性、细胞凋亡率、NLRP3、裂解的(Cleaved)Caspases-1、Cleaved-GSDMD 和 Cleaved-IL-1β 蛋白表达水平显著升高(P＜0.05);与缺氧组1比较,低剂量单宁酸组、高剂量单宁酸组细胞存活率显著升高,LDH活性、细胞凋亡率、NLRP3、Cleaved-Caspases-1、Cleaved-GSDMD 和 Cleaved-IL-1β 蛋白表达水平、分泌的 IL-1β 水平显著降低(P＜0.05).与缺氧2组比较,缺氧+鱼藤酮抑制剂组线粒体ROS、NLRP3、Cleaved-IL-1β蛋白表达水平显著升高(P＜0.05);与缺氧+高剂量单宁酸组比较,缺氧+鱼藤酮抑制剂+高剂量单宁酸组的线粒体ROS(0.85±0.02 vs 0.40±0.03)、NLRP3(0.61±0.03 vs 0.47±0.05)、Cleaved-IL-1β 蛋白表达水平(0.70±0.06 vs 0.48±0.09)显著升高(P＜0.05).结论 单宁酸可通过抑制ROS/NLRP3通路介导的焦亡,减轻缺氧诱导的H9c2细胞损伤.

目的 探究线粒体复合物Ⅰ抑制剂对糖尿病小鼠糖代谢的影响及机制.方法 通过高脂饲养联合链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型,设置健康对照组、糖尿病组、鱼藤酮组,经过6周的干预后,检测各组小鼠体质量、每日进食量、空腹血糖、腹腔注射葡萄糖耐量、胰岛素耐量指标及肝脏肌肉糖原沉积量.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测肝脏和肌肉葡萄糖转运蛋白 1(glucose transporter 1,GLUT1)、GLUT2、GLUT4 的 mRNA 表达水平,Western blot法检测真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eIF2α)磷酸化水平和转录活化因子4(acti-vating transcription factor 4,ATF4)蛋白表达水平.结果 与糖尿病组小鼠比较,鱼藤酮组小鼠的体质量、血糖以及腹腔内葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)和胰岛素耐量试验(insulin tolerance test,ITT)的曲线下面积显著下降,肝糖原储备明显增加.与健康对照组比较,糖尿病组小鼠肝脏GLUT1和GLUT2,肌肉GLUT1和GLUT4mRNA表达水平显著降低,而鱼藤酮组上述GLUT表达较糖尿病组明显升高.与健康对照组比较,糖尿病组p-eIF2α、ATF4蛋白表达水平显著升高,而鱼藤酮组p-eIF2α、ATF4蛋白表达水平较糖尿病组明显下降.结论 抑制线粒体复合物Ⅰ可能通过eIF2α/ATF4信号通路上调GLUT表达,改善糖尿病小鼠糖代谢和胰岛素抵抗.

目的 评价抗寄生虫中药水提物和有机溶剂粗提物体外对细粒棘球蚴的作用效果.方法 从感染绵羊肝脏细粒棘球蚴包囊中分离原头节,体外培养24h后,取活性大于95％的原头节(100 μl,约100个)加入96孔板,分别加入终浓度为0.8 mg/ml(低浓度组)、1.6 mg/ml(中浓度组)、3.2 mg/ml(高浓度组)的鸦胆子、苦楝皮、辣蓼、石榴皮、使君子、槟榔、贯众、鱼藤、马蔺子、五倍子和仙鹤草等11种抗寄生虫中药的水提物,体外作用72 h后,伊红染色法检测原头节活性,倒置显微镜观察下观察原头节的形态,计算死亡率;同时设相同浓度的阿苯达唑组和空白对照组.从具有体外抗原头节作用的中药中提取黄酮、多糖、皂苷和生物碱等粗提物,分别以终浓度1.00 mg/ml体外作用于原头节72 h后,观察原头节形态,计算死亡率;同时设空白对照组.对体外抗原头节效果明显的粗提物进行液相色谱与串联质谱联用分析.组间比较采用单因素ANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 中药水提物作用72h后,鸦胆子、苦楝皮、辣蓼水提物高浓度组原头节边缘模糊,结构松散,基质溶解;其余8种中药水提物高浓度组原头节形态正常,各部分结构清晰;阿苯达唑组原头节生发层有轻微损伤;空白对照组原头节形态正常.体外培养72 h后,鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物高浓度组原头节的死亡率分别为(99.63±0.57)％、(90.89±1.10)％和(51.93±0.60)％,中浓度组分别为(85.97±1.50)％、(81.14±1.19)％、(42.46±0.56)％,低浓度组分别为(78.34±1.35)％、(77.27±0.92)％、(36.66±0.60)％,与空白对照组[(0.62±0.51)％]相比差异均有统计学意义(F=180 678.22、41 488.99、44 346.38,19 543.86、27 887.32、34 590.79,20 059.467、41 953.68、17 993.77,均 P＜0.01),与阿苯达唑组[(30.03±2.02)％]比较差异均有统计学意义(F=6 585.72、4 210.84、646.46,2 956.80、2 849.68、210.83,2 365.92、2 712.28、58.12,均 P＜0.01);其余8种中药水提物高、中、低浓度组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷、辣蓼皂苷和辣蓼生物碱组原头节皱缩、结构松散、基质溶解,原头节死亡率分别为(98.33±2.89)％、(96.67±5.77)％、100％、(99.33±1.15)％和(56.67±2.11)％,与空白对照组[(10.33±2.51)％]比较差异均有统计学意义(F=1 584.00、563.71、3 808.47、3 099.52、14.65,均P＜0.01);其余中药粗提物组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).液相色谱与串联质谱联用分析结果显示,正、负离子模式下分别鉴定出741、398种代谢产物,其中正离子模式下从鸦胆子黄酮粗提物中鉴定出差异显著的黄酮类化合物4种,分别为漆黄素、5-甲基-7-甲氧基异黄酮、儿茶素和甜橙黄酮;负离子模式下鉴定出8种,分别为原花青素B2、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、枸桔苷、橙皮素、槲皮素、木犀草素、芹菜素和黄豆黄素.结论 鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物,鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷和辣蓼皂苷有明显体外抗细粒棘球蚴的作用,且效果优于阿苯达唑.

目的:探讨"调神畅志"针刺法对帕金森伴便秘(Parkinson's disease with constipation)模型大鼠结肠组织中5-羟色胺4受体(5-HT4R)及钙调蛋白(CaM)-肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路影响的研究,并探讨其可能作用机制.方法:采用随机数字表将60只大鼠分为空白组、假手术组、模型组、西药组、常规针刺组、调神畅志针刺组,每组10只.模型组、常规针刺组、调神畅志针刺组颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制造PDD大鼠模型,并用阿扑吗啡(APO)诱导检测.常规针刺组选取天枢、足三里、上巨虚及舞蹈震颤控制区,接电针,连续波频率15Hz,刺激强度2 mA,留针30分钟,1 日 1次,连续4周;调神畅志针刺组:选取王顺教授"调神畅志"三六九针法,百会透太阳、中脘、气海、足三里、太冲,采用连续波,头针频率45Hz,腹针频率30Hz,肢体针频率15Hz(体现调神畅志三六九针法的头针重、腹针中、四肢针轻的量化刺激),刺激强度约2 mA,留针30 min,1日1次,连续4周;西药组采用美多芭、莫沙必利每日灌胃,连续治疗4周;模型组、假手术组:每日2 mL生理盐水灌胃,连续4周;空白组不予处理.采用Western blot法检测各组近端结肠组织中5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达以及含量水平.结果:与空白组相比,模型组大鼠近端结肠组织中5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达水平显著降低(P＜0.01),与模型组比较,三个治疗组(西药组、常规针刺组、调神畅志针刺组)近端结肠组织5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达水平显著升高(P＜0.01).与常规针刺组相比,调神畅志组5-HT4R、CaM及MLCK蛋白表达水平明显升高(P＜0.05).结论:针刺可改善PD伴便秘大鼠模型便秘症状,且调神畅志针刺组优于常规针刺组,其作用机理可能通过调节大鼠结肠组织中5-HT4R蛋白表达以及激活CaM-MLCK信号通路来实现的.

目的:观察电针干预对帕金森病(PD)小鼠中脑黑质铁死亡及细胞凋亡相关蛋白的影响,探讨电针治疗PD的作用机制.方法:将C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组及电针组,每组8只.采用鱼藤酮连续灌胃4周构建PD小鼠模型.电针组于造模成功后针刺"百会",电针"曲池""足三里",20 min/次,1次/d,每治疗5 d休息2 d,共14 d.分别在造模前、造模后和电针干预结束后以旷场实验检测小鼠旷场中心区域停留时间、平均运动速度及运动总距离.干预结束后用Western blot法检测小鼠黑质二价金属离子转运体1(DMT1)、膜铁转运蛋白1(FPN1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平;免疫组织化学法检测小鼠黑质神经元形态变化及酪氨酸羟化酶(TH)阳性表达.结果:与空白组比较,造模 4周后模型组小鼠旷场中心区域停留时间、平均运动速度及运动总距离均减少(P<0.0001,P<0.01,P<0.001);黑质中DMT1、Bax蛋白表达水平均升高(P<0.001,P<0.0001),FPN1、GPX4、Bcl-2蛋白表达水平及黑质内TH+细胞吸光度值均降低(P<0.0001,P<0.001).与模型组比较,电针组小鼠中心区域停留时间、平均运动速度及运动总距离均增加(P<0.01,P<0.05);黑质中DMT1、Bax蛋白表达水平均降低(P<0.01,P<0.001),FPN1、GPX4、Bcl-2蛋白表达水平及黑质内TH+细胞吸光度值均升高(P<0.0001,P<0.01,P<0.001,P<0.05).结论:电针干预对PD模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元具有保护作用,其作用机制可能是通过调节铁死亡诱导的氧化应激及细胞凋亡实现的.

目的 基于体外实验及网络药理学,初步探讨二肽激肽酶4(DPP-4)抑制剂对鱼藤酮(ROT)诱导神经细胞帕金森病(PD)的干预作用及其相关机制.方法 神经细胞株PC-12分为对照组、模型组、模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组,除对照组外各组均使用ROT建立PD体外模型,模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组在使用ROT建模的同时在培养基中分别加入DPP-4抑制剂西格列汀、利格列汀、维格列汀.倒置显微镜观察各组细胞形态学变化,CCK-8法观察各组细胞增殖能力.从Swiss Target Prediction、SEA等数据库分别获取DPP-4抑制剂西格列汀、利格列汀、维格列汀、沙格列汀及阿格列汀的药物靶点,通过DisGeNet、OMIM及GeneCards等数据库获取PD相关的疾病靶点,利用韦恩图将药物与疾病靶点取交集得到DPP-4抑制剂作用于PD的相关靶点.通过String数据库构建蛋白—蛋白相互作用(PPI)网络,选取基因满足度(Degree)值>平均值的基因作为DPP-4抑制剂对PD产生作用的关键靶点,将DPP-4抑制剂作用于PD的关键靶点基因输入到DAVID数据库进行GO基因功能和KEGG作用通路分析.将DPP-4抑制剂治疗PD的关键靶点以及KEGG信号通路导入到Cytoscape 3.7.2软件构建药物—疾病—靶点—通路网络,筛选与PD相关信号通路关系最为密切的靶点作为DPP-4抑制剂治疗PD的核心靶点,采用CB-Dock 2对接平台进行核心靶点的分子对接验证.结果 对照组细胞形态完整,增长状态良好,细胞呈多角形,细胞之间类似突触样连接,且突触较长;模型组细胞密度减少,细胞皱缩,细胞与细胞间的突触样连接断裂,且观察到较多圆形的损伤细胞;模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组较模型组细胞形态得到改善,恢复到正常状态下的细长、多角形态.模型组细胞存活率低于对照组、模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组(P均<0.05).共收集西格列汀药物靶点486个、利格列汀药物靶点665个、维格列汀药物靶点524个、沙格列汀药物靶点507个、阿格列汀药物靶点408个,PD疾病相关靶点1121个;将DPP-4抑制剂靶点与PD疾病相关靶点取交集共得到DPP-4抑制剂作用于PD的36个相关靶点.PPI网络显示,DPP-4抑制剂作用于PD相关靶点中Degree值>平均值的关键靶点共有16个,分别为ALB、IGF1、STAT3、CASP3、EGFR、ESR1、MAPK14、PPARG、MAPK1、HMOX1、NOS3、REN、MMP3、IL2、AR、IGF1R.GO分析结果显示,DPP-4抑制剂作用于PD的关键靶点共同涉及的生物过程主要包括信号转导、细胞迁移的正向调控和细胞凋亡的负向调控等,细胞组分主要包括细胞质、细胞质膜、细胞核等,分子功能主要包括酶结合、蛋白质结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等.KEGG通路富集分析共得到20条信号通路,与PD较为相关的信号通路为PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路.药物—疾病—靶点—通路网络图显示,在PI3K-AKT、FoxO及MAPK信号通路中均有富集的靶点为IGF1、EGFR、IGF1R及MAPK1.分子对接结果显示,5种DPP-4抑制剂均与PD相关核心靶点蛋白有较好的结合,其结合能均小于-5.0 kcal/mol.结论 DPP-4抑制剂对PD体外模型细胞具有积极地干预作用,其可能通过IGF1、EGFR、IGF1R及MAPK1等核心靶点作用于PI3K-AKT、FoxO、MAPK等信号通路来发挥作用.