目的:制备特异性抗镰刀菌鸡卵黄抗体(IgY)并检测其对温度和pH的耐受性及抗真菌作用。方法:取22周龄莱杭母鸡18只，采用随机数表法将其随机分为阴性对照组和实验组，每组9只。制备灭活镰刀菌丝悬液，将菌丝浓度2×10 7菌落形成单位(CFU)/ml的菌悬液与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化后，对实验组莱杭母鸡进行免疫，每只鸡注射1 ml，2周后换为弗氏不完全佐剂加强免疫。在免疫后的第5~16周每周收集卵黄，用硫酸铵盐析法制备IgY，将得到的蛋白溶液放入冻干机中制作成冻干粉，4 ℃保存。以质量分数0.9%氯化钠溶液代替菌悬液按照同样方式进行阴性对照组莱杭母鸡的注射，以制备非特异性抗体作为实验中的阴性对照。采用考马斯亮蓝法测定特异性IgY蛋白浓度，采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定其效价。将1×10 5 CFU/ml和1×10 3 CFU/ml镰刀菌悬液与不同浓度IgY及磷酸盐缓冲液(PBS)混合培养4 d后测定吸光度( A)值，用PBS及非特异性IgY与镰刀菌悬液共孵育作为空白对照组及阴性IgY组，绘制抗镰刀菌IgY的抑菌曲线。用pH 7.4的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，分别在30、40、50、60、70、80和90 ℃水浴中孵育30 min后冷却至室温；此外，用pH值为l、2、3、4、5、6、7、8、9、l0、11和12的PBS将特异性IgY溶液稀释至0.02 mg/ml，4 ℃下放置1 h，均采用间接ELISA法测定抗体活性，评估IgY对不同温度和pH的耐受性。取SPF级8周龄雌性C57BL/6小鼠12只，采用随机数表法将其分为PBS对照组和特异性IgY治疗组，每组6只。用镰刀菌感染小鼠右眼角膜，建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，建模后1 d，特异性IgY治疗组用200 mg/ml特异性抗镰刀菌IgY点眼，PBS对照组用PBS点眼，于感染后1、3和5 d在裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜，根据炎症评分表对真菌性角膜炎的严重程度进行评分。 结果:免疫后第5~16周的IgY蛋白质量浓度分别为1.57、2.89、24.98、25.09、23.89、25.78、21.57、21.37、18.98、15.78、14.67和12.67 mg/ml。特异性抗镰刀菌IgY的效价从第5周开始升高，第7周时达到最高效价，为1∶10 000，可维持至免疫后12周，12周后抗体效价逐渐下降。抑菌曲线显示，与空白对照组和阴性IgY组相比，特异性IgY治疗组镰刀菌生长缓慢。抗体效价高于1∶10 000的特异性IgY在60 ℃以下具有较好的热稳定性；在pH 4~6具有最高活性，在pH 3~9的免疫活性能够保持在70%以上，随着pH值的进一步降低或升高，其活性迅速降低。镰刀菌感染后1、3和5 d，PBS对照组角膜炎症评分分别为3.50±0.55、7.33±0.82和4.00±0.63，特异性IgY治疗组角膜炎症评分分别为3.33±0.82、4.17±0.75和2.50±0.55。2个组不同时间点炎症评分总体比较，差异均有统计学意义( F分组＝247.35， P<0.05； F时间＝23.19， P<0.05)，其中镰刀菌感染后3 d和5 d，与PBS对照组相比，特异性IgY治疗组小鼠真菌性角膜炎炎症评分降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:用硫酸铵盐析法可成功制备高效价特异性抗镰刀菌IgY，其稳定性高，对温度和酸碱度均有一定的耐受性，可以在小鼠的真菌性角膜炎模型中减轻角膜溃疡的严重程度，降低炎症评分。

目的 制备及评估一种以幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)为靶点的特异性卵黄抗体.方法 脲酶阳性胃黏膜样本采自富顺县人民医院,微需氧条件下分离培养幽门螺杆菌;PCR扩增HpaA片段,原核表达形式获得HpaA重组蛋白并以Westem blot 检测其抗原性;与弗氏佐剂充分乳化后免疫产蛋鸡,水稀释-盐析法纯化卵黄抗体;SDS-PAGE、ELISA及Dot blot分析其生物学特性并评估对分离株体外生长的抑制效果.结果 分离株脲酶、氧化酶、触酶反应阳性;HpaA片段长702 bp,重组HpaA蛋白相对分子质量约为45 000,可溶形式表达且具有良好的抗原性;以其制备的IgY-HpaA滴度高达1∶150 000,1∶1 000稀释后仍能良好地识别分离株,5 mg/ml剂量可显著抑制分离株的生长.结论 以HpaA为靶点制备的卵黄抗体在体外可特异性识别并抑制幽门螺杆菌的生长.

目的 探讨高效价、高纯度且生物活性好的抗铜绿假单胞菌(PA)的特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备工艺.方法 采用超声破碎、共振裂解、研磨破碎等方法裂解PA,筛选出最佳裂解抗原,然后将裂解抗原或经甲醛灭活的全菌抗原与佐剂充分乳化免疫产蛋母鸡;采用酶联免疫吸附试验检测水稀释后的Ig Y抗体效价变化;通过硫酸铵盐析,超滤法纯化抗体,并用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝电泳法(SDS-PAGE)和二喹啉甲酸(BCA)法测定抗体纯度和浓度,平板法评价IgY对PA的抑菌效果,并以蒸馏水作为对照;扫描电镜法检测细菌形态变化.结果 超声破碎法裂解的PA抗原浓度最高且蛋白条带最为完整;0.5 mL的1×109 CFU/m L灭活菌初次免疫4周后再次免疫的方案产生的抗体效价最高,可高达1:25600;硫酸铵沉淀,超滤纯化后的抗体纯度可达94％,浓度为27.02 mg/mL;IgY体外抑菌试验表明,2.7 mg的抗体能明显抑制PA生长,与蒸馏水对照组相比,IgY试验组菌落数减少了9/10,并且明显抑制了细菌绿色色素的产生;扫描电镜观察Ig Y试验组菌体较长、较大且皱缩.结论 采用灭活全菌免疫母鸡,经水稀释、硫酸铵沉淀、超滤纯化的制备方法可得到高纯度和高效价的抗PA IgY,所制抗体具有特异性和显著抑菌活性.

鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)又称卵黄抗体,是禽类受特定抗原刺激后分泌的特异性抗体.因具有耐热、耐酸和抗蛋白酶降解等特性,早期开发产品作为食品或食品添加剂应用受到重视,其产品开发在食品安全、生态农业方面有重要社会效益和经济效益,产品由于含针对某病原生物特异性抗体,可抵抗病原生物的感染,因而在动物及人类疾病的防治方面有开发应用价值,在人类健康保健也有十分重要的应用前景.本文就动物和人类抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤等相关的IgY生物制剂产品研发及应用进行综述.

目的 观察一种手足口病病毒抗体制剂对病毒的灭活效果及其毒性.方法 采用病毒悬液定量灭活试验和动物试验方法,对一种病毒抗体液体制剂灭活肠道71型病毒的效果及其毒性进行实验室观察.结果 该病毒抗体通过病毒接种蛋鸡产蛋卵黄提取制备而成,总效价为1:32.以3种病毒抗体原液作用10 min,对肠道71型病毒和柯萨奇A16型病毒的灭活对数值均为3.50;对柯萨奇A10型病毒灭活对数值为1.25.病毒抗体原液对家兔完整皮肤多次刺激试验结果为无刺激性;对家兔眼黏膜刺激试验结果为无刺激性.结论 肠道71型病毒和柯萨奇A16型病毒所产生的抗体对其病毒具有较好的灭活效果,且对皮肤黏膜无刺激性.

目的 抗体药物是目前生物医药的研究热点问题之一.文章旨在研制抗人异麦芽糖酶(hISO)卵黄抗体(I-IgY)并检测其生物学活性. 方法 将hISO重组蛋白作为抗原与弗式佐剂充分乳化后免疫蛋鸡,水稀释-硫酸钠提取法提取抗人I-IgY,分别通过SDS-PAGE、Westem blot和ELISA等实验技术分析该抗体的纯度、特异性、效价和稳定性,PNPG法测定该抗体对α-葡萄糖苷酶的体外抑制效果. 结果 获得了抗人I-IgY,其效价最高可以达1∶12800,该抗体可特异性结合hISO重组蛋白,且具有较好的热稳定性、酸碱稳定性及胃蛋白酶抗性. 结论 成功制备了抗人I-IgY,为后续对2型糖尿病口服降糖药物的研制奠定实验基础.

目的 制备特异性的抗幽门螺杆菌(Hp)多价卵黄抗体(IgY).方法 将纯化重组的Hp血型抗原结合黏附素2(BabA2)、尿素酶B亚单位(UreB)和鞭毛蛋白A亚单位(FlaA)三种抗原等比例混合免疫产蛋鸡,取其所产鸡蛋的蛋黄,采用水溶盐析法纯化IgY.采用SDS-PAGE、Western blot法及间接ELISA分析IgY的生物学特性,体外将(1、5、10) mg/mL IgY与Hp菌液共培养后测定A600值,分析IgY的抑菌效果.结果 经产蛋鸡免疫,蛋黄液中IgY滴度可达1∶150000.体外抑菌表明5 mg/mL多价IgY可显著抑制幽门螺杆菌的生长,且与抗生素阿莫西林联合使用可显著性抑制菌体生长.结论 成功制备了抗幽门螺杆菌多价卵黄抗体.

目的 制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)抗原的卵黄抗体IgY,建立检测MRSA的酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)方法 . 方法 用大肠埃希菌原核表达并纯化PBP2a,采用胸部肌肉多点注射方式免疫产蛋母鸡,水稀释法粗提IgY,BCA法测定蛋白浓度,Western blot分析其特异性;以IgY抗体为捕获分子,以生物素标记的PBP2a特异性适配体为检测分子,建立检测MRSA的ELONA方法;对IgY包被量、生物素标记适配体用量及HRP标记链霉亲和素稀释度进行优化,测定该方法的灵敏度、特异性和重复性. 结果 成功表达和纯化PBP2a蛋白,Western blot显示IgY抗体能特异识别PBP2a蛋白.建立了检测MRSA的ELONA方法,其最佳包被用IgY稀释度为1∶1 600,生物素标记适配体用量为400 nmol/L,HRP标记链霉亲和素稀释度为1∶2 000.优化的ELO-NA对MRSA的检测限为2.87×102 CFU/ml;重复性试验的变异系数为4.7％.用该方法检测34株临床分离的金黄色葡萄球菌,与梅里埃VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统分析结果 一致性为100％. 结论 制备的抗MRSA PBP2a卵黄抗体具有较高特异性,基于该抗体建立的ELONA方法灵敏、特异、重复性好,可用于MRSA PBP2a的检测.

目的:串联表达变形链球菌毒力基因gtfS、gbpB的重组融合蛋白,将其作为免疫抗原制备特异性卵黄抗体,并研究该卵黄抗体的免疫活性.方法:以变形链球菌标准菌株UA159的基因组为模板,通过PCR方法扩增gtfS的CAT区和gbpB的SYI区,以SOE-PCR方法将其串联成基因片段CAT-SYI.在限制性内切酶EcoRⅠ-HF和XhoⅠ及T4 DNA连接酶的作用下构建重组质粒pET32a-CAT-SYI,转化表达菌株E.coli BL21,用1 mmol/L IPTG诱导表达后超声破碎重组菌,将提取纯化的重组融合蛋白免疫产蛋鸡并从鸡蛋中提取卵黄抗体,利用ELISA、Western blot和斑点杂交分析该抗体的特异性和免疫活性.结果:经PCR、SOE-PCR成功扩增出约750 bp的串联基因CAT-SYI,SDS-PAGE检测结果表明其表达产物约50 kD,与目的蛋白大小符合.ELISA间接法测得卵黄抗体的效价可达1:100000以上,Western blot鉴定结果显示IgY的特异性,在相对分子量约为35 kD和70 kD处出现相应的条带,斑点杂交检测结果显示特异性卵黄抗体具有识别变形链球菌的能力.结论:制备的特异性卵黄抗体具有良好的抗变形链球菌免疫活性,为免疫防龋奠定了基础.

目的:制备并纯化抗变异链球菌卵黄抗体(抗S.mutans-IgY),观察其对变异链球菌(Streptococcus mu-tans,S.mutans)胞外多糖、葡糖基转移酶活性、生物膜形成及活性的影响.方法:将甲醛灭活的S.mutans免疫150日龄白航蛋鸡4次,每次间隔10 d,取鸡蛋用两步硫酸铵沉淀法提取IgY,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immu-nosorbent assay,ELISA)检测免疫后效价变化.蒽酮法测定水不溶性及水溶性胞外多糖;Neson-Somogyi法测定葡萄糖基转移酶活性;二甲氧唑黄[2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2 H-tetrzo lium hydroxide,XTT]还原比色法研究IgY对生物膜总量的影响;采用激光共聚焦显微镜观察牙菌斑生物膜中死菌和活菌的构成.结果:经4次免疫后抗体最高效价为1:256000,维持40 d;IgY对S.mutans合成水不溶性胞外多糖的能力较对照组有明显抑制(P<0.01);药物作用后S.mutans还原糖、酶活力均降低(P<0.01);XTT法结果显示IgY对S.mutans生物膜抑制率为17.02％～74.13％;激光共聚焦显微镜观察到随着药液浓度增加,绿色的活菌、团块结构减少,生物膜厚度明显减小.结论:一定浓度IgY能够抑制S.mutans的增殖,具有抗龋作用.