[目的]日本落叶松黄烷酮 3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase 2,LkF3H2)基因在类黄酮生物合成过程中发挥着重要的调控功能.探究LkF3H2 基因在日本落叶松中发挥的具体功能和植物类黄酮生物代谢过程.[方法]根据实验室前期转录组数据克隆日本落叶松LkF3H2 基因并进行生物信息学分析及组织表达分析.随后将该基因转化烟草进行转基因烟草组织表达分析及类黄酮含量测定,以探究基因表达量与类黄酮含量之间的关系.[结果]LkF3H2 基因cDNA序列长度为 1074 bp,其蛋白编码 358个氨基酸,分子式C1785H2807N481O541S18,分子量为 40.24 kD,该蛋白是不稳定的亲水性蛋白且不含信号肽;同时系统进化分析得出日本落叶松LkF3H2 与火炬松、辐射松、白云杉和欧洲云杉F3H亲缘关系较近并且该蛋白含有保守结构域 2OG-Fe(Ⅱ)oxygenase superfamily,属于 2-酮戊二酸依赖性双加氧家族.另外组织表达分析显示LkF3H2 基因在一月龄日本落叶松幼苗叶中表达量最高,在一年生日本落叶松幼苗茎中表达量最高,并且在转基因烟草叶中也显示了最高的表达量.值得一提的是,转基因烟草叶中的类黄酮含量也是最高的,其次为茎和根,转基因烟草中类黄酮含量与LkF3H2基因表达量呈正相关关系.[结论]日本落叶松LkF3H2基因属于 2-酮戊二酸依赖性双加氧家族并且在类黄酮生物合成过程中发挥着重要功能.

黄酮碳苷是一类广泛参与植物防御反应且有着广泛药理活性的天然产物,同时也是霍山石斛中一类重要活性成分.黄烷酮合酶Ⅱ已被证实是植物黄酮碳苷合成途径的关键酶,其催化产物 2-羟基黄烷酮是多数已报道黄酮碳苷合成的前体化合物.该研究基于已报道的黄烷酮合酶Ⅱ氨基酸序列,从构建的霍山石斛基因组本地化数据库中筛选并验证出一个黄烷酮合酶Ⅱ(DhuFNSⅡ)基因,验证其功能发现该酶可体外催化柚皮素和乔松素分别生成芹菜素和白杨素.DhuFNSⅡ的开放阅读框(ORF)为 1 644 bp,编码547 个氨基酸,亚细胞定位显示该蛋白定位在内质网上.RT-qPCR结果表明DhuFNSⅡ在茎中的表达量最高,其次是叶、根.霍山石斛经 4 种生长过程中常遇的非生物胁迫处理后,各组织中DhuFNSⅡ等目标基因的表达量均发生显著上调,但在各处理组中的上调程度却各不相同,其中干旱和冷胁迫对基因表达量影响更为显著.通过对DhuFNSⅡ的鉴定与功能分析,将有助于解析霍山石斛品质代谢物黄酮碳苷形成的分子机制,并为其品质形成及科学栽培提供参考.

植物色素主要有花青素、类胡萝卜素和生物碱类色素三大类,其中花青素是决定大部分被子植物组织或器官颜色的重要色素.花青素通过类黄酮途径合成,该途径是生物学上研究较多且较为清楚的代谢途径之一.近年来的研究表明,在该途径中除了查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)和黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydrolase,F3H)起着关键作用外,二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reduc-tase,DFR)对花青素的合成也至关重要.DFR可催化3种二氢黄酮醇和2种黄烷酮生成5种不同的花青素前体,且 D FR基因家族不同成员对各个底物的催化效率不同,因此它在一定程度上决定着植物中花青素的种类和含量,从而影响植物组织或器官的颜色.该文对近年来国内外有关DFR在花青素合成过程中的生物学功能与调控,包括DFR的特征、作用机制和系统进化以及环境、转录因子和一些结构基因与DFR的关系等方面的研究进展进行了综述,以期为DFR今后的研究和利用基因工程改变植物组织或器官的颜色提供理论依据.

目的 从布渣叶中克隆黄酮碳苷合成途径关键酶黄烷酮-2-羟化酶(flavanone 2-hydroxylase,F2H)基因,构建原核表达载体,对其进行生物信息学和表达模式分析.方法 根据布渣叶转录组数据中注释为F2H的Unigene设计特异性引物,利用PCR法扩增MpF2H基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),基于在线工具对cDNA序列进行生物信息学分析.同时,依据F2H序列,设计特异引物,采用RT-qPCR方法对其在芽、叶、枝、花、果等组织中的表达进行测定.结果 MpF2H基因ORF全长为1 557 bp(Genbank登录号KY652921),编码518个氨基酸;相对分子质量54 500,理论等电点5.49,含有信号肽,不含跨膜域,可能定位于叶绿体.同时,MpF2H基因在不同组织中均有表达,其中在叶中表达量最高,在枝和花中表达量最低.结论 MpF2H基因在不同组织中表达量差异较大.克隆了MpF2H基因cDNA,构建了其原核表达载体pET30a-MpF2H,为MpF2H基因的原核表达和功能验证奠定了基础.

为了探究百合花色的调控机制,以东方百合品种‘索邦’(Sorbonne)的花蕾为试验材料,根据前期转录组测序结果,成功克隆出黄烷酮3羟化酶(flavanone 3 hydroxylase,F3H)基因的编码序列和基因组序列,其中,编码序列全长1 110 bp,可编码369个氨基酸;基因组序列全长1 438 bp,包含3个外显子和2个内含子,命名该基因为LhSorF3H(GenBank登录号为MF614135).生物信息学分析结果显示,黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性.LhSorF3H编码的蛋白与郁金香(Tulipa fosteriana)最为相似.半定量RT-PCR结果显示,LhSorF3H在花被、柱头以及花柱中表达明显,在花丝、子房、嫩茎、茎生根及上部叶片中表达较弱,而在花药和中下部叶片中基本不表达.LhSorF3H在不同发育阶段的花被片中均有表达(S2和S6阶段除外);黑暗处理使LhSorF3H表达降低,黑暗处理2h的LhSorF3H表达量降到最低,之后表达量开始上升;转入光照条件后,LhSorF3H的表达水平持续增加.研究表明,LhSorF3H基因对昼夜节律和光照具有双重响应的特性.

以‘凤丹’牡丹的组培苗为材料,在含有0-5.0 mg/L硝酸银的基础培养基中进行培养后,通过测量总酚含量、单体酚种类及其含量的变化和相关基因的表达情况,确定不同浓度的硝酸银对抑制愈伤组织褐化的作用.结果表明,培养基中加入硝酸银能够抑制相关基因的表达,明显降低愈伤组织中多酚类物质的含量进而减轻植物组织褐变程度,其中2.0 mg/L的综合效果最好;硝酸银对组培苗褐变过程中产生影响的单体酚有绿原酸、芦丁、香豆酸、对香豆酸、表儿茶素、二氢槲皮素;硝酸银处理后的的愈伤组织中,转录因子MYB2、WD40-1、WD40-2与结构基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黄烷酮醇还原酶(DFR)、查耳酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、3-二氢黄酮羟化酶(F3H)、黄酮醇3'-羟化酶(F3'H)的表达量与褐变等级和总酚含量之间存在显著的相关性(P＜0.05).

目的 为了研究独行菜黄酮类化合物生物合成途径的关键基因,从独行菜中克隆了黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)基因,命名为LaF3H,并进行序列分析、原核表达和纯化.方法 根据独行菜转录组数据中LaF3H 基因序列设计特异性引物,克隆LaF3H 基因的cDNA 序列,构建pET-32a-LaF3H 原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达LaF3H 重组蛋白.结果 LaF3H 基因开放阅读框(ORF)长1 080 bp,编码359个氨基酸,其蛋白质相对分子质量为40 320.序列分析结果表明LaF3H 具有F3H 蛋白的5个保守基序,系统进化分析结果显示LaF3H 蛋白与拟南芥等十字花科植物F3H 蛋白同源性较高.通过构建原核表达载体pET-32a-LaF3H,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达LaF3H 重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的LaF3H 重组蛋白.结论 克隆了LaF3H 基因,获得LaF3H 纯化蛋白,为下一步制备LaF3H 蛋白抗体、酶学活性检测,研究LaF3H 基因在独行菜黄酮类化合物生物合成途径中的功能奠定基础.

该研究以藤茶叶片为材料,利用RACE技术克隆得到1个黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因,命名为AgF3 H(登录号为JX087441).AgF3H基因的cDNA全长为1 323 bp,其中开放阅读框长1 092 bp,编码363个氨基酸,含有双加氧酶家族的2个特征性结构域和5个保守基序.序列比对与系统进化树分析显示,AgF3H与其他物种F3H的氨基酸序列具有较高的相似性,且与葡萄、山葡萄和圆叶葡萄的亲缘关系最近.qRT-PCR结果显示,AgF3H基因在藤茶不同组织部位都有表达,在芽中的表达量最高,嫩茎中最低,在叶片中的表达量随着成熟度的增加而逐渐降低;不同组织中的AgF3H基因表达量与藤茶类黄酮主要成分二氢杨梅素的含量呈显著正相关.构建AgF3H基因过表达载体并导入烟草中,获得5株转基因植株,其中4株烟草的叶片总黄酮含量比野生型对照有不同程度提高,最高株系提高了26.8％.研究表明,AgF3H基因可能在藤茶类黄酮的生物合成中起重要作用,研究结果为进一步研究藤茶高黄酮含量形成的分子机制奠定了基础.

罗布麻(Apocynum venetum L.)突变体的获得是人工创新种质资源的有效途径,也是开展品种选育、功能基因组研究的基础.本研究以采自东营野生罗布麻种子作为材料,预试验结果表明0.7％的甲基磺酸乙酯(EMS,ethylmethylsulfone)溶液诱变罗布麻种子13h能够达到半致死剂量.在此浓度和处理时间下构建了一个1452株的突变体群体,对获得的M1植株进行农艺性状和总黄酮含量性状筛选,初步获得125份农艺性状突变材料,其中包括8株白化植株、23株叶型变异株、16株叶色黄纹突变体、32株苗期分枝植株以及46株叶位变异突变体,突变频率分别为0.55％、1.6％、1.1％、2.2％和3.2％.此外,还筛选到2株总黄酮含量明显高于野生型和1株低于野生型的材料.在突变群体中对黄酮代谢途径中编码黄烷酮-3-羟化酶的基因(F3H,flavanone 3-hydroxylase gene)进行测序鉴定,结果鉴定到3株F3H基因的突变体.本研究构建的罗布麻突变体库表型丰富且突变位点可以鉴定,是罗布麻新种质筛选、品种选育以及基因功能研究的良好材料.

该研究以自育茶菊品种‘14-C-1’为材料,克隆了一个黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因,命名为CmF3H.生物信息学分析表明,‘14-C-1’CmF3H的cDNA序列(GenBank登录号MW454869)全长为1284 bp,开放阅读框为1095 bp,编码364个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为41.19kD,等电点为5.57,不稳定系数为39.51,平均亲水性-0.465,脂肪系数为83.02.氨基酸序列分析表明,‘14-C-1’CmF3H蛋白属于2-酮戊二酸依赖双加氧酶(2-ODD)蛋白家族,具有2-酮戊二酸双加氧酶结构域.系统发育分析结果显示,‘14-C-1’与菊花栽培种‘SU07’处于同一进化节点上,二者亲缘关系最近.采用染色体步移方法克隆了‘14-C-1’CmF3H启动子序列(GenBank登录号MW463894),全长1217 bp,启动序列分析发现其含有光响应元件、干旱和ABA响应元件、MYB识别和结合位点和组织器官发育元件等.实时荧光定量PCR分析表明,CmF3H在‘14-C-1’的根、茎、叶、花蕾、舌状花和筒状花等不同组织部位均有表达,在筒状花中表达量最高,其次为茎、叶、花蕾、舌状花,根中表达量最低.该研究结果为进一步揭示菊花黄酮类化合物的生物合成机制奠定了基础.