目的 探讨环磷酰胺(CTX)及其活性代谢衍生物4-氢过氧环磷酰胺(4-HC)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的损伤效应及其机制.方法 用CTX[0(细胞对照),0.01,0.1,1,5,10,20,40和80 mmol·L-1]和4-HC[0(细胞对照),0.01,0.1,1,5,10,20,40和80 μmol·L-1)]处理SH-SY5Y细胞48 h,应用IncuCyte ZOOM系统记录细胞形态变化和生长曲线;CCK-8法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞LDH释放率.CTX(0,1,5,10和20 mmol·L-1)和4-HC(0,1,5,10和20 μmol·L-1)处理SH-SY5Y细胞48 h,用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色法检测细胞增殖;免疫荧光法检测DNA双链断裂标志物γ-H2AX的含量和线粒体膜电位变化.CTX(0,1,5和10 mmol·L-1)和4-HC(0,1,5和10 μmol·L-1)处理SH-SY5Y细胞48 h,SeaHorse XF检测细胞糖酵解及线粒体氧化磷酸化水平.结果 与细胞对照组相比,CTX组和4-HC组的细胞融合率曲线逐渐下降;细胞活力显著下降(P<0.01),半数抑制浓度(IC50)分别为4.44 mmol·L-1和4.78 μmol·L-1;LDH释放率显著增加(P<0.01);EdU+细胞百分比显著降低(P<0.01);γ-H2AX+细胞百分比显著升高(P<0.05);线粒体膜电位显著降低(P<0.05);CTX和4-HC处理导致最大糖酵解能力、酵解储备、最大呼吸速率和ATP产生速率显著降低(P<0.05).结论 CTX和4-HC对SH-SY5Y细胞具有细胞毒性作用,可降低细胞活力,破坏细胞膜结构,抑制细胞增殖,其机制可能与导致细胞DNA损伤、能量代谢紊乱和线粒体功能障碍密切相关.

目的:探讨不同剂量远志皂苷对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用,及对环磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的调节作用.方法:将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性组及远志皂苷高、中、低剂量组.实验一:除空白组外,其余各组均注射D-半乳糖溶液1.25g/kg建立衰老小鼠模型,高、中、低剂量组依次喂饲400、200、100mg/kg的远志总皂苷,4周之后分别测定各组小鼠的脾脏指数、胸腺指数、血清中过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力和脑组织丙二醛(MDA)含量、SOD活力.实验二:除空白组外,其余各组腹腔注射环磷酰胺(30mg/kg)制作免疫抑制小鼠模型,空白组注射同等剂量的0.9％氯化钠溶液;远志皂苷高、中、低剂量组分别灌胃400、200、100m g/kg的皂苷,其余各组灌胃等量的蒸馏水.连续给药2周后,测量各组小鼠的脾脏指数和胸腺指数,并用ELISA法验测出血清细胞因子白介素2(IL-2)和白介素6(IL-6)的含量.结果:抗衰老作用研究表明,与模型组比较,高、中剂量组的胸腺指数和脾脏指数均显著降低(P＜0.01,P＜0.05),血清的CAT活力极显著升高(P＜0.01);低剂量组的SOD活力显著升高(P＜0.05).高、中、低剂量组脑组织的MDA水平、SOD活力亦统计学差异(P＜0.05).免疫功能调节作用研究表明,与模型组比较,远志皂苷高、中剂量组均显著升高脾脏指数和胸腺指数(P＜0.05,P＜0.01);皂苷高剂量组的血清细胞因子IL-2和IL-6的含量均显著升高(P＜0.01).结论:远志皂苷具有抗衰老及增强免疫功能的作用.

目的 建立基于96孔板的Bhas 42细胞转化试验高通量检测方法,并探讨此方法用于药物非临床阶段体外致癌性评价的前景.方法 建立Bhas 42细胞转化试验96孔板高通量检测方法,使用己知阳性诱癌物苯并芘(Benzoapyrene,BaP)和环磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)为对照品,比较转化灶人工计数法和过氧化氢高通量96孔板法对结果判定的影响.进行试验的细胞在接种后第19天以一定浓度的过氧化氢处理细胞24 h.24 h后,洗去含过氧化氢的培养基,加入新鲜培养基并加入CCK-8染色孵育2～4 h后测定450 nm波长吸光度以确定细胞转化率.同时,转化灶人工计数法细胞在第21天经甲醇固定,吉姆萨染液染色后计数每孔克隆数,对比两种方法的差异性.结果 转化灶人工计数法中,与阴性对照组比较,BaP和CP在启动试验中均被评价为阳性;过氧化氢高通量法得到与转化灶人工计数法相同的结果.结论 成功建立了基于96孔板的Bhas 42细胞转化试验的过氧化氢高通量检测方法,该方法相比于传统方法可简单、快速地检测化合物诱导Bhas 42细胞的转化效率,并提高了结果评判的客观性.

目的:研究槲皮苷对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用.方法:50只小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组.采用一次性腹腔注射环磷酰胺(CTX)(200 mg/kg)方式建立小鼠免疫抑制模型,对照组腹腔注射等体积生理盐水.低、中、高剂量组分别灌胃20、50、80 mg/kg的槲皮苷,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水.14 d后测定胸腺及脾免疫器官指数、腹腔巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数、脾脏组织T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+亚群及其比例、血浆IgG和IgM、IL-2和IL-4水平并观察脾脏组织病理学状态.以流式细胞术检测抗氧化指标活性氧(ROS),ELISA试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT).Western blot检测小鼠脾脏组织核转录因子kappaB(NF-κB)p65和TLR2蛋白表达水平,对槲皮苷的干预作用机制进行探索.结果:与对照组相比,模型组的免疫器官指数、腹腔巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数、CD4+、CD8+亚群及其比例、IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、CAT均显著降低(P<0.05),脾脏病理学损伤明显,而ROS和MDA水平则显著升高(P<0.05);较模型组而言,给予槲皮苷干预后,各组免疫器官指数、腹腔巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数、CD4+、CD8+亚群及其比例、IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、CAT均剂量依赖性地显著升高(P<0.05),脾脏病理学损伤程度呈剂量依赖地减轻,而ROS和MDA水平则剂量依赖性显著降低(P<0.05).Western blot法检测显示模型组的NF-κB p65和TLR2蛋白均较对照组显著上调(P<0.05);槲皮苷干预各组的NF-κB p65和TLR2蛋白表达水平则剂量依赖性显著下降(P<0.05).结论:槲皮苷可改善小鼠免疫功能低下状态,通过促进免疫器官功能恢复及提高机体抗氧化水平来提高免疫功能低下小鼠的免疫水平,其作用机制可能与TLR2信号通路有关.

为探讨槲皮苷(quercitrin,QI)联合电针(electroacupuncture,EA)刺激对免疫抑制小鼠免疫功能的影响,将实验小鼠随机分为对照组(Control)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)模型组、QI组和QI+ EA联合治疗组.用CTX建立免疫抑制小鼠模型后,第2d起各组分别给予生理盐水、QI灌胃及QI灌胃联合EA刺激,连续治疗14d.治疗结束后,称重法测定胸腺及脾脏指数;HE染色法观察脾脏组织学变化,吉姆萨染色法测定腹腔巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数;ELISA检测小鼠血浆IgG和IgM、IL-2和IL-4水平以及抗氧化相关指标如超氧化物歧化酶(superoxide diamutase,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)水平;FACS检测脾脏CD4+、CD8+T细胞亚群以及组织活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平;Western blotting检测脾脏组织Nrf2总蛋白及核蛋白、总NQO1、HO-1蛋白、NF-κcBp65及TLR2蛋白的表达水平.结果 显示,CTX组的免疫器官指数、巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数、IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、CAT及CD4+、CD8+T细胞亚群等指标均较对照组明显降低(P＜0.05),而脾脏组织损伤程度、MDA、ROS及Nrf2、NQO1、HO-1、NF-κB p65、TLR2水平则均显著升高(P＜0.000 1);相较于CTX组,QI组小鼠免疫功能相关指标及SOD、CAT水平和Nrf2、NQO1、HO-1蛋白水平均显著升高(P＜0.05),而脾脏组织损伤程度、MDA、ROS及NF-κB p65、TLR2蛋白水平均显著下降(P＜0.05);联合EA可进一步加强QI的上述作用(P＜0.0001).由此,EA联合QI对免疫抑制小鼠有保护作用,可通过提高免疫器官功能及抗氧化水平促进小鼠的免疫力,具体作用机制可能是通过激活抗氧化应激Nrf2/ARE通路而起到提高免疫力的作用.

目的:探讨心理应激对小鼠脂肪组织黄嘌呤氧化酶表达、活性及相关指标的作用.方法:雄性无特定病原体(SPF)级20只昆明小鼠随机分2组(每组10只),即慢性束缚应激(Stress)组和正常对照(Control)组.Stress组小鼠每天在自制式束缚器中限制活动2 h,其余时间两组小鼠在相同环境中自由饮水摄食,实验持续14 d,取血和白色脂肪组织(WAT);观察脂肪组织病理学改变,检测WAT中黄嘌呤氧化酶(XO)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox-4)的蛋白水平,检测WAT组织中XO、Nox-4、超氧化物歧化酶(Mn SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、脂联素(ADPN)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)、组织因子(TF)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的mRNA表达,检测血清和WAT组织中XO酶活性以及血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-Cho)、游离脂肪酸(FFA)、尿酸(UA)的含量.结果:与control组比较,stress小鼠腹股沟WAT组织中XO免疫染色阳性着色细胞黄褐色沉淀深且丰富,WAT中出现大量的单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞浸润反应和炎症性的改变;血清XO浓度、WAT组织中XO mRNA水平和XO的酶活性显著升高(P<0.01),血清游离脂肪酸(FFA)和尿酸(UA)的含量显著增高(P<0.01),WAT组织中Nox-4蛋白、MCP-1、IL-6、TNF-α、TF、PAI-1mRNA的表达水平显著增高(P<0.01),而Mn-SOD、GSH-Px、CAT、ADPN、IRS-1和GLUT-4的mRNA水平则显著降低(P<0.01).结论:心理应激可诱发脂肪XO过量表达及其活性增高,进而引起脂肪炎症、糖代谢及凝血酶原异常等反应.

目的 探讨绵羊肝脏和肺脏细粒棘球蚴原头节差异蛋白质表达谱,为虫体生长、发育调控特异性蛋白筛选奠定基础.方法 提取寄生于绵羊肝脏与肺脏棘球蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE分析后,利用iTRAQ和液相色谱法以及串联质谱分析(LC-MS/MS)寄生于绵羊肝脏和肺脏细粒棘球蚴原头节蛋白质表达谱,通过Mascot软件和GO软件分析寄生于绵羊肝脏和肺脏棘球蚴原头节的差异表达蛋白质.结果 本研究共鉴定了1229个有意义的蛋白质点,通过肝脏与肺脏比较有无差异性(肝脏原头节VS肺脏原头节)和调节趋势后获得217个差异表达蛋白质,在肝脏上调蛋白74个(脂肪酸绑定蛋白、a纤维蛋白原、环氧化物酶、过氧化氢酶、酰基COA合成酶、载脂蛋白A4、磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖内脂酶、乙酰辅酶酰基转移酶、还有一些未鉴定的蛋白等);下调蛋白143个(乳酸脱氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、内质网氧化还原酶、肌动蛋白、肌球蛋白、天冬酰胺酶、铁蛋白、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、热休克蛋白90、胶原纤维Ⅰ,胶原纤维Ⅳ、波形蛋白、玻连蛋白、磷脂转运蛋白、磷酸甘油酸激酶).结论 本研究发现寄生于绵羊肝脏和肺脏棘球蚴原头节蛋白质表达存在差异.

目的:利用网络药理学研究由当归芍药散合金匮肾气丸化裁而来的补肾和脉方治疗高血压的作用机制.方法:基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获取补肾和脉方的化学成分和作用靶点,构建化合物-靶点网络.通过TTD、OMIM、DrugBank、GAD、PharmGKB、DisGeNET数据库筛选高血压靶点.基于补肾和脉方作用靶点与高血压靶点的交集结果,建立蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,分析交集靶点之间的相互作用,通过拓扑结构筛选关键靶点.利用DAVID 6.8数据库对交集靶点进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析.结果:从补肾和脉方中筛选出110个有效成分,得到可能作用于高血压的83个交集靶点.进一步筛选出11个关键靶点,包括白细胞介素-6(IL-6)、一氧化氮合酶3(NOS3)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGFA)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(ACHE)、JUN、钠依赖性血清素转运体(SLC6A4)和凝血酶(F2).GO分析得到28条生物过程,主要涉及腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、药物反应、缺氧反应、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号通路、血管收缩的正调节等;KEGG富集分析得到45条信号通路,主要涉及神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路、5-羟色胺能突触通路、环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶(PKG)信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、TNF信号通路等.结论:补肾和脉方治疗高血压是多靶点、多途径的直接或间接协同作用.

目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对4-过氧化氢环磷酰胺(4-hydroperoxy cyclophosphamide,4-HC)诱导人颗粒细胞(granulosa cells,GCs)氧化应激损伤改善作用.方法 收集体外受精-胚胎移植患者卵泡液GCs进行体外培养.苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色对GCs鉴定,Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测4-HC诱导GCs毒性和RES对4-HC诱导GCs毒性改善作用.将GCs分为3组:对照组、4-HC组、RES+4-HC组.CCK-8测定GCs存活率,活性氧荧光探针DCFH-DA检测GCs内活性氧(reactive oxygen species,ROS),水溶性四氮唑1测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),钼酸铵法检测过氧化氢酶(catalase,CAT),Western Blot测定沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 1,SIRT1)蛋白表达.结果 4-HC(0,1.0,2.5,5.0,7.5μmol/L)处理GCs,CCK-8结果显示随4-HC浓度增加,GCs存活率降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),选择2.5μmol/L 4-HC为后续4-HC模型浓度.RES(0、5、10、25、50、75μmol/L)处理GCs 2 h后加入2.5μmol/L 4-HC,结果显示,RES可提高GCs存活率,与4-HC组比较,差异有统计学意义(P<0.05).选择50μmol/L RES为后续改善浓度.对3组GCs处理后各项检测结果显示,与CON组比较,4-HC组GCs存活率、SOD、CAT降低,ROS增加(P<0.05).与4-HC组比较,RES+4-HC组GCs细胞活率、SOD、CAT增加,ROS降低.Western Blot显示RES+4-HC组SIRT1升高,与其他2组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 RES可能通过增加SIRT1表达改善4-HC诱导GCs损伤.

目的 探讨巴戟天寡糖对环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导骨质疏松雄性小鼠氧化应激指标和股骨组织形态的影响,并探析炮制工艺对巴戟天寡糖成分及效用的影响.方法 对巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分进行提取分离并验证.将雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组、维生素D3(5μg/kg)组及巴戟天寡糖低、高剂量(50、200mg/kg)组和酒巴戟天寡糖低、高剂量(50、200mg/kg)组.除对照组外,其余小鼠连续15 d ig CTX(4.5 mg/kg)制备骨质疏松模型,造模结束后,给予相应药物干预4周,测定各组小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;采用Micro-CT对股骨远端骨微结构进行分析;采用三点弯曲法测定骨生物力学参数;制片测量骨组织形态计量学参数.结果 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖的6种寡糖成分的含量不同,巴戟天寡糖中D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量较酒巴戟天寡糖更多,而酒巴戟天寡糖中D(+)-无水葡萄糖的含量更多.与模型组相比,巴戟天寡糖低剂量组小鼠股骨的骨密度显著增加(P<0.01);骨生物力学参数改善(P<0.05、0.01);血清MDA水平降低(P<0.05);松质骨的骨小梁面积比(percentage of trabecular bone area,Tb.Ar)、荧光标记周长比(percentage of fluorescent label perimeter,L.Pm)、骨矿化沉积率(mineral apposition rate,MAR)及骨形成率(bone formation rate to bone volume,BFR/BV)显著升高(P<0.05、0.01),骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)和破骨细胞数目(number of osteoclast,OC.N)显著降低(P<0.01);皮质骨的MAR显著降低(P<0.05),BFR/BV显著升高(P<0.01).巴戟天寡糖高剂量组小鼠骨密度显著增加(P<0.01);血清中CAT活性显著升高(P<0.01);松质骨组织中Tb.Ar显著升高(P<0.05),Tb.Sp显著降低(P<0.05).酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠骨密度显著增加(P<0.01);骨生物力学参数改善(P<0.05);血清GSH-Px活性升高(P<0.01);松质骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV显著升高(P<0.05、0.01),Tb.Sp和OC.N显著降低(P<0.05、0.01);皮质骨的MAR显著降低(P<0.05),BFR/BV显著升高(P<0.05).酒巴戟天寡糖高剂量组小鼠血清中CAT活性显著升高(P<0.01),对于骨结构改变则无明显影响作用.结论 不同炮制工艺会影响巴戟天寡糖的成分含量.巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均能不同程度地改善氧化应激指标,但低剂量的巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖对于改善CTX引起的骨质疏松的作用更为显著.