目的:探讨胞裂蛋白9(SEPTIN9)基因甲基化对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:采用亚硫酸盐测序聚合酶链式反应(PCR)法检测正常食管上皮细胞HEEC与食管癌ECA109、KYSE150细胞中SEPTIN9基因甲基化水平。分别应用甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dc)(实验组)和二甲基亚砜(DMSO)(对照组)与细胞共培养72 h，采用实时荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法(Western blot)检测SEPTIN9 mRNA及其蛋白，采用噻唑蓝(MTT)法及膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素标记磷脂结合蛋白(Annexin V-FITC)凋亡实验检测增殖与凋亡，Transwell小室法检测迁移和侵袭。组间比较采用独立样本 t检验。 结果:食管癌细胞ECA109、KYSE150的SEPTIN9基因甲基化程度高于正常食管上皮细胞HEEC[(83.69±7.15)%比(21.36±4.58)%；(84.26±6.97)%比(21.36±4.58)%， t＝12.714、13.063， P<0.01]。实验组食管癌细胞ECA109、KYSE150 SEPTIN9 mRNA及SEPTIN9蛋白相对表达量高于对照组(1.66±0.17比1.23±0.12、1.68±0.20比1.25±0.13；1.76±0.18比1.35±0.15、1.85±0.21比1.38±0.16， t＝3.579、3.122、3.031、3.083， P<0.05)。实验组食管癌细胞ECA109、KYSE150增殖能力低于对照组(0.38±0.06比0.91±0.17、0.40±0.05比0.97±0.16， t＝5.092、5.890， P<0.01)。实验组食管癌细胞ECA109、KYSE150凋亡率高于对照组[(35.69±4.37)%比(17.89±2.26)%、(41.18±5.49)%比(18.96±3.05)%， t＝6.267、6.128， P<0.01]。实验组食管癌细胞ECA109、KYSE150迁移细胞数目、侵袭细胞数目少于对照组[(116.75±12.59)个比(187.24±19.26)个、(120.24±13.68)个比(193.25±20.34)个；(61.34±7.52)个比(108.35±12.56)个、(63.58±6.69)个比(112.24±15.06)个， t＝5.905、5.159、5.562、5.114， P<0.01]。 结论:抑制SEPTIN9基因甲基化可使食管癌细胞中SEPTIN9基因重新表达，从而抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。

目的:探讨甲基化酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza)对变异性鼻炎大鼠辅助性T细胞(helper T cell，Th)亚群Th1和Th2细胞的分化及白细胞介素(interleukin，IL)-4、干扰素(interferon，IFN)-γ水平表达的影响。方法:将30只SD雄性大鼠随机分为3组：正常组、模型组、5-aza组，每组10只。予以卵清蛋白致敏的方法建立变应性鼻炎模型，分别干预后采血行流式细胞术检测Th1、Th2细胞比率，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ和Th2细胞分泌的细胞因子IL-4的表达，并留取鼻粘膜行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining ，HE)染色。结果:流式细胞术检测结果显示，模型组中Th2细胞的比率均较5-aza组和正常组明显升高[(7.28±1.37)%比(6.17±1.06)%，(6.05±0.95)%， F＝2.920， P<0.05]，差异具有统计学意义；5-aza组Th2细胞的比率明显低于模型组，差异具有统计学意义( P＝0.039)；模型组、5-aza组和正常组的Th1细胞比率差异无统计学意义( P>0.05)。ELISA法检测结果显示，模型组大鼠IL-4的表达水平明显高于正常组和5-aza组，差异具有统计学意义[(175.19±10.14) pg/mL比(160.14±16.86) pg/mL，(160.75±17.45)pg/mL， F＝2.743， P<0.05)]。5-aza组IL-4的表达水平较模型组明显降低( P＝0.047)，但三组间IFN-γ的表达表达水平差异无统计学意义( P>0.05)。HE染色光镜下可见，正常组大鼠鼻粘膜组织结构完整、清晰，鼻粘膜无水肿，充血；模型组鼻粘膜固有层充血、水肿，粘膜下层腺体增生，血管增生，并有大量炎性细胞及嗜酸性粒细胞浸润，鼻粘膜纤毛破坏；5-aza组鼻粘膜组织结构大致完整，可见少量嗜酸性粒细胞浸润。 结论:甲基化酶抑制剂能有效缓解大鼠过敏性鼻炎症状，减轻过敏大鼠的鼻粘膜组织损伤。提示甲基化酶抑制剂可能使得Th2表达下调抑制炎性反应。

目的:探讨黑色素瘤相关抗原C2(MAGE-C2)在乳腺正常组织、良性病变组织和癌组织中的表达、表达机制及临床意义。方法:分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法检测60例乳腺正常组织、60例乳腺良性病变组织和60例乳腺癌组织中MAGE-C2 mRNA和蛋白的表达，分析其与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系。以DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)干预人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231后，采用RT-PCR法检测MAGE-C2 mRNA表达的变化。结果:乳腺癌组织中MAGE-C2 mRNA阳性表达率为61.7%(37/60)，MAGE-C2蛋白阳性表达率为58.3%(35/60)，乳腺正常组织和良性病变组织中未见MAGE-C2 mRNA及蛋白的表达。MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌的病理类型、组织学分级、脉管瘤栓有关(均 P<0.05)。MAGE-C2蛋白表达阳性乳腺癌患者的无复发生存率低于MAGE-C2蛋白表达阴性的患者( χ2＝4.467， P＝0.035)。多因素Cox回归分析显示，临床分期( HR＝4.715， P＝0.004)、淋巴结转移( HR＝3.827， P＝0.023)和MAGE-C2蛋白表达( HR＝4.229， P＝0.026)是乳腺癌患者无复发生存的独立影响因素。对照组和TSA组乳腺癌细胞中未见MAGE-C2 mRNA表达，5-aza-CdR组乳腺癌细胞中可见MAGE-C2 mRNA表达(MCF-7细胞为0.2914±0.0274，MDA-MB-231细胞为0.4808±0.0288)，联合应用5-aza-CdR和TSA可使乳腺癌细胞中MAGE-C2 mRNA表达进一步增加(MCF-7细胞为1.0357±0.0644，MDA-MB-231细胞为1.6013±0.0675)。 结论:MAGE-C2是肿瘤特异性抗原，其表达与乳腺癌患者的不良预后有关，DNA甲基化和组蛋白乙酰化可能是调控MAGE-C2基因表达的重要机制。

目的:探讨不同化疗药物联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-dC）对肺腺癌细胞A549细胞凋亡的影响。方法:采用前瞻性随机对照研究方法，分别使用顺铂、紫杉醇、吉西他滨及5-Aza-dC联合药物处理A549细胞。根据药物干预方式的不同分为对照组、顺铂联合紫杉醇（TP）组、顺铂联合吉西他滨（GP）组及5-Aza-dC分别联合TP、GP用药组。使用CCK-8法检测各组药物对A549细胞增殖能力的影响；Transwell迁移、侵袭实验检测各组药物对A549细胞迁移和侵袭能力的影响。实时荧光定量聚合酶链式反应检测各药物处理对凋亡基因表达水平的影响。对不同药物处理组细胞增殖程度的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD- t法。 结果:TP组24、48、72 h不同时间点对肺腺癌细胞的抑制率分别为（20.00±4.23）%、（35.00±2.80）%，（56.00±3.11）%；5-Aza-dC联合TP组对肺腺癌细胞的抑制率显著增加，在24、48、72 h不同时间点分别为（38.00±3.80）%、（50.00±3.25）%、（93.00±4.33）%。GP组24、48、72 h不同时间点对细胞的抑制率分别为（33.00±5.10）%、（54.00±3.80）%、（74.00±2.82）%；而5-Aza-dC联合GP方案可显著抑制细胞生长，24、48、72 h不同时间点对细胞的抑制率分别为（54.00±3.00）%、（67.00±5.30）%、（95.00±1.13）%。同一药物对肺腺癌细胞的抑制作用随着时间的延长而增强（TP组： F=35.93， P<0.001；5-Aza-dC联合TP组： F=97.33， P<0.001；GP组： F=41.73， P<0.001；5-Aza-dC联合GP组： F=79.00， P<0.001），且不同时间点，两两比较差异均有统计学意义（均 P<0.05）。5-Aza-dC联合TP、GP化疗方案可抑制肺腺癌细胞A549的迁移和侵袭，且比TP或者GP组的抑制效果更强；5-Aza-dC联合GP方案与单独应用GP方案相比，细胞凋亡蛋白Caspase 8的表达水平显著升高（ t=5.87， P=0.004）；5-Aza-dC联合TP方案与单独应用TP方案相比，细胞凋亡蛋白Caspase 8（ t=3.94， P=0.017）、Caspase 6（ t=5.81， P=0.004）和BCL2结合蛋白3（BBC3）（ t=6.53， P=0.003）的表达水平升高。 结论:5-Aza-dC可能作为化疗增敏剂来增加肺腺癌细胞的敏感性。

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)CYP1B1-AS1对急性髓系白血病细胞增殖和迁移的影响及机制.方法:实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CYP1B1-AS1在急性髓系白血病细胞系THP-1、NB4、HL-60、KG-1、SKM-1和骨髓基质细胞HS-5中的表达量.通过5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理急性髓系白血病细胞系,RT-qPCR检测5-Aza-CdR对CYP1B1-AS1表达的影响.根据转染物不同分别将HL-60细胞分为NC组和CYP1B1-AS1组.克隆形成实验和划痕实验依次检测HL-60细胞的增殖和迁移能力.双荧光素酶实验验证CYP1B1-AS1 与微小 RNA(miR)-1306-5p 的靶向关系.RT-qPCR 检测 CYP1B1-AS1 对 HL-60 细胞 miR-1306-5p表达的影响.免疫印迹法检测CYP1B1-AS1对HL-60细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期素E(Cyclin E)和转录因子(Twist)、纤维连接蛋白(Fibronectin)表达的影响.结果:与HS-5细胞比较,CYP1B1-AS1在急性髓系白血病细胞系中表达量降低,且HL-60细胞系中CYP1B1-AS1表达量最低(均P＜0.05).5-Aza-CdR能够明显促进急性髓系白血病细胞系中CYP1B1-AS1的表达(均P＜0.05).与NC组比较,CYP1B1-AS1组HL-60细胞增殖能力和迁移率降低(均P＜0.05).过表达miR-1306-5p能够抑制野生型CYP1B1-AS1的荧光素酶活性(P＜0.05).与NC组比较,CYP1B1-AS1组HL-60细胞中miR-1306-5p表达减少,细胞增殖和迁移相关蛋白CDK2、Cyclin E、Twist、Fibronectin表达降低(均P＜0.05).结论:过表达CYP1B1-AS1可能通过靶向下调miR-1306-5p表达抑制急性髓系白血病细胞的增殖和迁移.

目的 在胰腺癌中探讨 HOXA11 基因启动子区甲基化状态及其作为诊断标志物的可能性.方法 应用半定量 RT-PCR和甲基化特异性 PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术检测 8 株胰腺癌细胞系中 HOXA11 的表达及启动子区甲基化情况,应用MSP 在 216 例胰腺癌组织中检测 HOXA11 启动子区甲基化情况,并分析 HOXA11 启动子区甲基化与临床病理因素之间的相关性.结果 HOXA11 在 Panc3.11、Panc5.04、Panc10.05、BXPC3 细胞中表达缺失,其 MSP 结果为完全甲基化.在 SW1990、AsPC1 中高表达,其 MSP 结果为非甲基化,在 CFPAC1 和 MIAPaCa2 细胞中表达减低,其 MSP 结果呈部分甲基化状态.应用 5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza)处理细胞后,HOXA11 在 Panc3.11、Panc5.04、Panc10.05、BXPC3 细胞中恢复表达,在 CFPAC1 和MIAPaCa2 细胞中表达增加,在 SW1990、AsPC1 细胞中表达水平无明显变化.在 216 例原发性胰腺癌患者中,76.85%(166/216)发生 HOXA11 甲基化,甲基化与肿瘤分化程度相关(P＜0.0003).结论 HOXA11 基因在胰腺癌组织中频繁发生甲基化,其表达受启动子区甲基化调控,HOXA11 甲基化是胰腺癌潜在的诊断标志物.

目的 CHFR基因是一种抑癌基因,低表达或表达缺失可能促淋巴瘤细胞增殖,PARP-1基因参与其对淋巴瘤细胞增殖的调控,本研究旨在通过过表达CHFR基因及分别沉默CHFR、PARP-1基因,观察其对裸鼠移植瘤Raji细胞的影响,探讨CHFR基因和PARP-1基因调控裸鼠Raji淋巴瘤细胞的增殖和凋亡机制.方法 在非霍奇金B细胞裸鼠Burkitt淋巴瘤移植瘤Raji细胞中,用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)过表达CHFR基因,及用慢病毒介导的shRNA分别沉默CHFR、PARP-1基因,测定各组裸鼠移植瘤的肿瘤的大小及重量;采用实时荧光定量PCR技术测定各组CHFR及PARP-1基因mRNA含量;应用MSP方法检测各组CHFR的甲基化状态;分别通过TUNEL试剂盒和免疫组化监测凋亡指数(AI)和微血管密度(MVD).结果5-Aza-dC组的裸鼠在非霍奇金B细胞Burkitt淋巴瘤移植瘤Raji细胞能增强CHFR基因mRNA的表达,降低PARP-1基因mRNA的表达;在体内环境中,5-Aza-dC能够促进移植瘤Raji细胞的凋亡,抑制移植瘤的生长(P＜0.05),这些结果与shRNA-CHFR组结果相反,与shRNA-PARP-1组结果一致.而且实验中可见5-Aza-dC组的裸鼠移植瘤的CHFR基因发生去甲基化.结论CHFR基因低表达促进肿瘤细胞增殖,PARP-1基因低表达促进肿瘤细胞凋亡,而5-Aza-dC可以去甲基化抑制肿瘤细胞增殖.

目的:分析桥接整合因子1 (bridging integrator-1,Bin1去甲基化对Bin1基因表达和食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制.方法:甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)法检测去甲基化药物5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)处理后EC109细胞Bin1启动子区域的甲基化状态,用qPCR、Westem blotting和MTT法分别检测单独5-Aza-dc和5-Aza-dc加转染Bin1基因干扰片段(Bin1 siRNA)处理对EC109细胞Bin1 mRNA及其蛋白表达和细胞增殖能力的影响,流式细胞术和Western blotting检测5-Aza-dc处理后EC109细胞周期和细胞周期相关蛋白(CyclinDl与CDK4)表达的变化.结果:去甲基化药物5-Aza-dc处理后,EC109细胞Bin1基因启动子区域发生去甲基化.5-Aza-dc处理的Bin1去甲基化EC109细胞Bin1 mRNA和蛋白表达明显上调(均P＜0.05),细胞增殖能力明显下降(P＜0.05),细胞阻滞在G0/G1期,表现为S期细胞比例显著减少,细胞周期相关蛋白CyclinD、CDK4表达均明显下调(均P＜0.05).Bin1去甲基化EC109细胞转染Bin1 siRNA后,Bin1 mRNA和蛋白表达明显下调,细胞增殖能力增强(均P＜0.05).结论:Bin1基因启动子区域在EC109细胞中呈完全甲基化状态,5-Aza-dc去甲基化可使食管鳞癌细胞EC109细胞Bin1表达升高,通过降低细胞周期相关蛋白表达诱导细胞周期阻滞抑制EC109细胞增殖.证实表观遗传学变化可能与食管癌细胞恶性增殖有关,可为食管癌治疗提供新的思路.

目的:探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷/曲古抑菌素A(5-Aza/TSA)介导的DNA去甲基化/组蛋白乙酰化处理对B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤B细胞表型的影响.方法:构建含有G418抗性的CD19特异性启动eGFP表达载体,转染霍奇金(阴性对照)和非霍奇金淋巴瘤细胞,并筛选目的序列稳定整合的克隆,比较CD19启动子在2组细胞中的活性.流式细胞术检测5-Aza/TSA处理对2组细胞GFP表达水平的影响.分离Eμ-myc转基因小鼠非霍奇金淋巴瘤原代细胞并鉴定其B细胞表型,通过流式细胞术检测5-Aza/TSA对其B细胞表面抗原CD19等表达水平的影响.结果:5-Aza/TSA表观遗传处理能够降低人非霍奇金淋巴瘤细胞中外源性CD19启动子的转录活性,并沉默小鼠原代非霍奇金淋巴瘤细胞表面B细胞特异性抗原的表达.结论:DNA甲基化和组蛋白去乙酰化对人类及小鼠B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤B细胞表型稳定有重要作用.

目的 探讨DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对食管鳞状细胞癌细胞株KYSE140和KYSE150生物学行为的影响.方法 KYSE140、KYSE150细胞分别设空白组、对照组和实验组,空白组细胞不做处理,对照组细胞中加入2 μmol/L二甲基亚砜(DMSO),实验组应用浓度为1、2、3、4 μmol/L 5-Aza-dC分别作用24、48、72、96 h.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对细胞增殖能力的影响,选择药物作用的最佳浓度和时间;Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力的改变;流式细胞术检测药物对细胞凋亡和细胞周期的影响;蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3和周期调控相关蛋白CCNB-1、CCNE-1的表达.结果 MTT法检测结果显示5-Aza-dC对KYSE140和KYSE150细胞最佳作用时间为96 h,最佳浓度为4 μmol/L.在此条件下,肿瘤细胞迁移、侵袭能力下降,空白组、对照组、实验组KYSE140和KYSE150细胞的迁移细胞数分别为(193.3±8.6)、(184.0±10.4)、(61.7±7.1)个和(112.0±6.4)、(101.3±7.9)、(26.3±5.7)个,侵袭细胞数分别为(47.3±7.3)、(38.7±5.1)、(8.0± 3.9)个和(83.3±6.8)、(74.7±5.7)、(21.0±2.7)个,差异均有统计学意义(均P<0.05).5-Aza-dC促进KYSE140和KYSE150细胞凋亡,空白组、对照组、实验组细胞凋亡率分别为(2.8±0.3)%、(11.2± 0.7)%、(18.6±0.6)%和(2.7±0.4)%、(9.8±0.4)%、(17.7±0.5)%,实验组较空白组、对照组G2/M期细胞比例增加,差异均有统计学意义(均P<0.05).实验组中凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3剪切作用增强,周期相关蛋白CCNB-1表达升高,CCNE-1表达降低.结论 5-Aza-dC可以抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖,促进其凋亡.