目的:制备一种靶向LMP1抗原的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），研究其对EB病毒（EBV）阳性淋巴瘤的免疫治疗作用。方法:应用分子克隆技术构建二代LMP1 CAR表达质粒，通过慢病毒包装体系包装病毒后感染人T细胞，获得LMP1 CAR-T细胞，体外实验验证LMP1 CAR-T细胞对感染EBV后的LMP1阳性淋巴瘤细胞的特异性细胞毒性作用。结果:①LMP1蛋白表达于EBV阳性的淋巴瘤细胞表面；②成功构建了二代LMP1 CAR慢病毒载体，感染人T细胞，获取LMP1 CAR-T细胞，感染效率大于80%；③LMP1 CAR-T细胞可特异性杀伤LMP1阳性淋巴瘤细胞，当效靶比按4∶1共培养48 h后，LMP1 CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤作用增强，对Ramos细胞无明显杀伤作用；④与LMP1阳性淋巴瘤细胞按1∶1共培养5 h后，LMP1 CAR-T细胞处理组CD107a + T细胞比例显著高于Vector-T细胞组[（13.25±2.94）%对（1.55±0.05）%， t＝3.972， P＝0.017]，脱颗粒效果增强；⑤与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞组CD69 +、CD25 + T细胞比例显高于Vector-T细胞组[（7.40±0.41）%对（3.48±0.47）%， t＝6.268， P＝0.003；（73.00±4.73）%对（57.67±2.60）%， t＝2.842， P＝0.047]，活化效应增强。⑥与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞组细胞因子分泌增强，高于Vector-T细胞组[IFN-γ：（703±73）ng/L对（422±87）ng/L， t＝2.478， P＝0.068；TNF-α：（215±35）ng/L对（125±2）ng/L， t＝2.536， P＝0.064]。 结论:该研究证实EBV阳性淋巴瘤细胞表面可特异表达LMP1蛋白，成功构建了LMP1 CAR慢病毒载体并感染人T细胞，成功获得LMP1 CAR-T细胞。体外实验证实：与LMP1阳性淋巴瘤细胞共培养后，LMP1 CAR-T细胞脱颗粒效果增强，活化效应增强，高效分泌细胞因子，可特异杀伤LMP1阳性淋巴瘤细胞，具有潜在的临床应用前景。

目的:探讨靶向B细胞淋巴瘤的分子探针 131I-ch4E5的制备方法及其对荷人B细胞淋巴瘤裸鼠的抑瘤作用。 方法:采用Iodogen法用 131I标记抗CD80的人-鼠嵌合抗体ch4E5，采用放射性薄层色谱扫描法测定标记率和放射化学纯度。（1）体外实验：在含细胞数为1×10 8、1×10 9、1×10 10、5×10 10、1×10 11个/L的人B细胞淋巴瘤Raji细胞的离心管中分别加入 131I-ch4E5溶液，同时设置非特异结合对照管，测量每管沉淀的放射性计数，计算Raji细胞与 131I-ch4E5的特异性结合率。（2）体内实验：3只荷瘤裸鼠尾静脉注射7.4 MBq的 131I-ch4E5，72 h后处死，分别取肿瘤、血等14种脏器或组织，分别计算肿瘤与正常组织的放射性比值（T/NT）；将15只荷瘤裸鼠按随机数字表法分为3组，分别经尾静脉注射 131I-ch4E5（ 131I-ch4E5组）、未标记的ch4E5(ch4E5组）及生理盐水（对照组），观察3组荷瘤裸鼠的肿瘤生长情况，给药后第15天计算肿瘤生长抑制率；之后处死荷瘤裸鼠取肿瘤组织，采用苏木精-伊红染色法做组织病理学检查。2组间的比较采用两独立样本 t检验。 结果:131I-ch4E5的标记率为（84.2±2.4）%、放射化学纯度为（97.1±1.1）%。（1）体外实验： 131I-ch4E5与Raji细胞的结合率随细胞数量的增加而升高，最大结合率为（38.2± 2.3）%。（2）体内实验： 131I-ch4E5在荷人B细胞淋巴瘤裸鼠体内的分布具有靶向性，肿瘤与肌肉的T/NT最大为7.30；与ch4E5组、对照组比较， 131I-ch4E5组肿瘤生长减慢，差异均有统计学意义（ t=2.889、6.516，均 P<0.05）；给药后第15天， 131I-ch4E5组肿瘤抑制率为71.7%、ch4E5组为43.4%。组织病理学检查结果同样显示 131I-ch4E5的治疗效果更明显。 结论:自制分子探针 131I-ch4E5的标记率及放射化学纯度高，且对荷人B细胞淋巴瘤裸鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，为进一步研究 131I-ch4E5在放射免疫治疗中的应用提供了实验依据。

目的:建立嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗相关细胞因子释放综合征(CRS)的小鼠模型。方法:通过分子克隆及慢病毒转染技术，构建靶向人CD19分子的CAR-T细胞，采用流式细胞术检测CAR-T细胞转染效率，酶联免疫吸附试验(ELISA)法及流式细胞术检测CAR-T细胞特异性杀伤靶细胞的能力。通过尾静脉注射CAR-T细胞至荷瘤重症联合免疫缺陷裸鼠体内，小鼠分为磷酸缓冲液组、低负荷组(注射1×10 5个人淋巴瘤细胞Raji-Luc2细胞)和高负荷组(注射5×10 5个Raji-Luc2细胞)。采用动物活体成像法检测肿瘤治疗效果，ELISA法检测小鼠血清中细胞因子人白细胞介素2(IL-2)、人γ-干扰素(IFN-γ)、鼠IL-6、鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。 结果:经尾静脉注射人T细胞和T细胞+OKT-3抗体后，T细胞组和T细胞+OKT-3组小鼠的健康得分分别为(1.15±0.08)分和(2.90±0.15)分，差异有统计学意义( P<0.001)。T细胞+OKT-3组小鼠血清中人IL-2、人IFN-γ、人IL-15、鼠IL-6、鼠GM-CSF水平分别为(1 064.00±50.14)、(1 285.00±193.90)、(202.4±18.76)、(1 478.00±289.20)和(350.70±42.27)pg/ml，均高于T细胞组[分别为(22.67±6.36)、(23.67±3.71)、(44.33±14.45)、(147.30±36.20)和(138.00±22.74)pg/ml，均 P<0.05]；OKT-3联合人T细胞引起小鼠血清中细胞因子人IL-2、人IFN-γ、鼠IL-6、鼠GM-CSF水平迅速升高，并伴有体温升高及体重下降。成功构建靶向CD19分子的CAR-T细胞，流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率>30%。ELISA结果显示，在CD19抗原存在时，CAR-T19细胞与Raji、Nalm-6共孵育组细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平分别为(561.00±37.07)、(680.30±71.27)、(369.00±25.71)和(523.00±26.31)pg/ml，均高于与K562共孵育组[分别为(55.00±20.53)和(64.00±7.55)pg/ml，均 P<0.001]。小鼠成像实验显示，小鼠成瘤后第7天经尾静脉回输活化后的CAR-T19细胞，成瘤第13天，低负荷和高负荷组小鼠肿瘤荧光强度均低于接种肿瘤的第7天，高负荷组肿瘤荧光强度由144.00±24.69减少至5.02±2.35( P＝0.005)，低负荷组肿瘤荧光强度由58.47±9.36减少至3.48±1.67( P＝0.004)。荷瘤小鼠注射CAR-T19细胞72 h后，血清中T细胞活化相关细胞因子人IL-2、人IL-15、人IFN-γ水平迅速增高，单核细胞相关因子鼠IL-16、鼠GM-CSF分泌增加，同时伴随有体温升高和体重降低等CRS典型特征。 结论:体外成功构建靶向CD19分子的CAR-T细胞，通过CAR-T细胞回输治疗验证了小鼠体内CRS现象的发生，为CAR-T细胞治疗相关CRS的发生机制及CRS预防策略提供了动物模型参考。

目的:制备靶向CD30单克隆抗体(简称单抗) 64Cu-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)-CD30，无创性可视化评价淋巴瘤CD30的表达。 方法:通过Western blot评价5种淋巴瘤细胞株(Karpas299、Raji、Daudi、Ramos和U266)中CD30的表达水平。选择高和低表达CD30的细胞株行流式细胞术评估抗CD30单抗特异性结合能力。取NSG小鼠13只构建CD30阳性和阴性皮下荷瘤鼠模型。标记获得 64Cu-NOTA-CD30，以 64Cu-NOTA-免疫球蛋白(Ig)G为对照探针。经尾静脉注射2种探针后2、24和48 h行microPET显像及生物分布分析。采用重复测量方差分析及Bonferroni法进行数据比较。 结果:Karpas299细胞呈CD30高表达，Raji细胞呈CD30低表达。流式细胞术示抗CD30单抗与Karpas299细胞特异性结合。 64Cu-NOTA-CD30与 64Cu-NOTA-IgG的放化纯均>95%。在microPET显像中，Karpas299肿瘤 64Cu-NOTA-CD30摄取随时间延长逐渐升高，2、24和48 h分别为(11.46±0.58)、(17.60±1.16)与(19.46±0.99)每克组织百分注射剂量率(%ID/g)；48 h时与本底对比度良好，肿瘤与心(血液)比值为2.20±0.22。48 h时， 64Cu-NOTA-CD30在Karpas299肿瘤的摄取高于其在Raji肿瘤[(6.10±1.03) %ID/g]及 64Cu-NOTA-IgG在Karpas299肿瘤的摄取[(5.12±0.89) %ID/g]，差异均有统计学意义( F＝290.99， t值：19.65和22.25，均 P<0.001)。 64Cu-NOTA-CD30与 64Cu-NOTA-IgG在各组心、肝的摄取随时间延长逐渐降低。48 h体外生物分布结果与活体microPET显像基本一致。 结论:64Cu-NOTA-CD30能在活体水平无创性可视化评价淋巴瘤CD30的表达及分布情况，有望应用于靶向CD30免疫治疗的受益群体筛选及疗效评价。

目的 研究红花黄色素调节Wnt/β-catenin信号通路对非霍奇金淋巴瘤(NHL)增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 体外培养Raji细胞,随机分为对照组(常规培养)、红花黄色素组(30 μg·mL-1红花黄色素)、氯化锂组(20 mmol·L-1 LiCl)、红花黄色素+LiCl组(30 μg·mL-1红花黄色素+20 mmol·L-1 LiCl).检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达、细胞增殖、凋亡、细胞周期分布、凋亡及细胞周期相关蛋白表达.裸鼠右前腋皮下接种Raji细胞构建NHL移植瘤模型,随机分为Nu-对照组、Nu-红花黄色素(7.5 mg·kg-1 红花黄色素 LiCl)组、Nu-LiCl(1 mg·kg-1 红花黄色素 LiCl)组、Nu-红花黄色素(7.5 mg·kg-1红花黄色素LiCl)+LiCl(1 mg·kg-1红花黄色素LiCl)组,以红花黄色素和LiCl分组处理后,检测各组裸鼠肿瘤质量和体积.结果 对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+LiCl组的Wnt1蛋白水平分别为 0.64±0.11、0.19±0.04、1.07±0.40、0.59±0.07,细胞凋亡率分别为(5.13±0.67)％、(57.68±7.31)％、(0.91±0.29)％、(7.24±1.40)％,B-淋巴细胞瘤(Bcl-2)蛋白相对表达水平分别为0.53±0.09、0.09±0.02、0.99±0.14、0.49±0.07,P21蛋白相对表 达水平 分别为0.56±0.12、1.08±0.20、0.13±0.04、0.59±0.11.上述指标:红花黄色素组、LiCl组与对照组相比,红花黄色素+LiCl组与红花黄色素组相比,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).Nu-对照组、Nu-红花黄色素组、Nu-LiCl组、Nu-红花黄色素+LiCl 组的肿瘤体积分别为(915.34±61.43)、(578.46±42.54)、(1 310.84±93.16)和(878.75±56.20)mm3,肿瘤质量分别为(0.86±0.13)、(0.45±0.09)、(1.31±0.15)和(0.75±0.17)g.上述指标:Nu-红花黄色素组、Nu-LiCl组与Nu-对照组相比,Nu-红花黄色素+LiCl组与Nu-红花黄色素组相比,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 红花黄色素可下调Wnt/β-catenin通路蛋白表达,从而诱导NHL细胞周期停滞,抑制其增殖及在裸鼠体内肿瘤生长,并促使其凋亡.

目的:研究NVP-BEZ23对耐阿霉素细胞株RAJI/DOX的逆转耐药作用.方法:利用浓度梯度法诱导耐阿霉素细胞株RAJI/DOX;Western blot测定各组细胞Pgp、p-AKT、p-mTOR蛋白水平;MTT法检测细胞抑制率,SPSS软件测定IC50.结果:成功诱导出耐阿霉素细胞株RAJI/DOX.耐阿霉素细胞株RAJI/DOX中Pgp、p-AKT、p-mTOR蛋白水平高于亲本细胞RAJI.NVP-BEZ235可引起耐阿霉素细胞株RAJI/DOX中p-AKT、p-mTOR蛋白水平下降.NVP-BEZ235能够抑制耐阿霉素细胞株RAJI/DOX增殖,与阿霉素具有协同作用.结论:PI3K/AKT/mTOR通道在耐阿霉素伯基特淋巴瘤细胞中进一步活化;NVP-BEZ235通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通道活化,能够与阿霉素协同抑制伯基特淋巴瘤耐药细胞,逆转伯基特淋巴瘤耐药细胞对阿霉素的耐药性.

目的 通过检测生物钟基因Bmal1、Per2 在血液肿瘤细胞株Raji、Hut-78、OCI-LY8 及HL-60 细胞中不同时间点的mRNA表达情况,探讨其与血液肿瘤发生发展的可能关系.方法 血液肿瘤细胞株Raji、Hut-78、LY-8、HL-60 经血清休克法诱导节律后,RT-PCR法检测生物钟基因Bmal1 及Per2 在不同时间点的mRNA转录水平,以时间为变量分别对其转录量进行余弦函数拟合,通过余弦函数预测基因转录高峰及低谷时段.结果 Bmal1 和Per2 基因表达在OCI-LY8、Hut-78、HL-60 细胞中呈现昼夜节律(P<0.05);Raji细胞内Bmal1 基因无节律性表达(P>0.05),而Per2 基因呈昼夜节律表达(P<0.05).结论 生物钟基因Per2 和(或)Bmal1 在多种血液肿瘤细胞株内呈昼夜节律性表达,其可能参与血液肿瘤的发生发展.

目的 应用CRISPR/cas9技术构建敲除CD19 的Raji-Luc淋巴瘤细胞,并对其免疫逃逸能力进行初步验证.方法 构建PB-CRISPR-CD19 小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)质粒,筛选最优的sgRNA序列,用pCAG-PBase转座酶、PB-CD19 sgRNA及PB-CRISPR-Cas9 共同电转染Raji-Luc细胞,采用流式分选和极限稀释法筛选得到稳定敲除的单克隆细胞株.经过基因序列检测对敲除效果进行验证;酶标仪检测细胞系表面荧光素酶的表达情况;以实验室前期构建的CD19 CAR-T和CD38 CAR-T作为效应细胞,用荧光素酶化学发光法验证Raji-Luc CD19 KO细胞株的免疫逃逸能力.结果 电转染制备的Raji-Luc CD19 KO细胞转染效率较高,筛选所得两组单克隆细胞敲除效率均达到 99%以上,与原始Raji-Luc细胞的荧光素酶表达无显著差异,且不能激活CD19 CAR-T细胞对其进行杀伤.结论 成功构建了Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系.

目的 探讨TCF3通过linc00152调控Daudi和Raji细胞增殖和凋亡中的功能和机制.方法 采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测linc00152的干扰效率;利用CCK8、Western blotting和流式细胞术检测linc00152对Daudi和Raji细胞增殖和凋亡的影响;ChIP-PCR检测TCF3与linc00152的启动子区结合;qPCR和Western blot-ting 检测TCF3的干扰效率;qPCR检测TCF3对linc00152表达水平的影响.结果 在Daudi和Raji细胞中siRNA能成功干扰linc00152的表达;CCK8结果显示,干扰linc00152能抑制Daudi和Raji细胞增殖,Western blotting和流式结果显示干扰 linc00152 能促进细胞凋亡(Daudi:35.30±2.84 vs.6.95±0.82;Raji:33.17±2.18 vs.6.47± 0.38);ChIP-PCR结果显示,TCF3能与linc00152的启动子结合;qPCR和Western blotting结果显示,TCF3的mRNA和蛋白水平均能被siRNA成功干扰;在Daudi和Raji细胞中,si-TCF3能降低linc00152的表达量(Daudi:0.509±0.048 vs.0.906±0.146;Raji:0.502±0.052 vs.0.966±0.103).结论 linc00152 能促进 Daudi 和 Raji 细胞增殖,抑制细胞凋亡,可能与TCF3对linc00152的调控有关.

目的:分析芒果苷(mangiferin)联合硼替佐米对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖、侵袭、凋亡和自噬的作用及对CXC趋化因子受体家族(CXCR)表达的影响,并探究其间存在的分子机制,为Burkitt淋巴瘤基础研究与临床提供科学依据.方法:采用不同浓度Mangiferin、硼替佐米单药或联合干预Raji细胞,利用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞侵袭能力,Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡、自噬及Akt/mTOR通路蛋白表达情况,实时荧光定量PCR检测CXCR家族的表达变化.结果:不同浓度Mangiferin干预Raji细胞不同时间后,可抑制Raji细胞活力,且呈浓度及时间依赖性(r=-0.682,r=-0.836);与单药组相比,Mangiferin联合硼替佐米干预Raji细胞时,细胞增殖与侵袭能力显著下降、凋亡水平显著升高(P＜0.01).Mangiferin联合硼替佐米干预Raji细胞后,可上调促凋亡蛋白Bax表达并显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时亦使Caspase-3水解活化,继而诱导Raji细胞发生凋亡.Mangiferin联合硼替佐米干预Raji细胞后可上调LC3 Ⅱ蛋白的表达,且细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较单药或对照组显著上调(P＜0.01).Mangiferin联合硼替佐米可显著抑制Akt和mTOR的磷酸化水平,通过抑制Akt/mTOR通路来使Raji细胞增殖及侵袭受抑,并诱导细胞发生自噬与凋亡.Mangiferin及硼替佐米单药干预Raji细胞后,可下调CXCR4、CXCR7 mRNA的表达,当两药联合时CXCR4、CXCR7 mRNA表达下调更为显著(P＜0.01).Mangiferin单药或联合硼替佐米干预Raji细胞后CXCR5 mRNA表达无显著变化(P＞0.05),但两药联合时可使CXCR3表达下调(P＜0.05).结论:Mangiferin联合硼替佐米能协同抑制Raji细胞增殖、侵袭,并诱导其发生自噬与凋亡,机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路并通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax以及使CXCR家族表达受抑等有关.