目的:探讨N6-甲基腺苷(m6A)去甲基化酶ALKBH5在人肝癌中的表达及其对抗肿瘤免疫的影响.方法:采用免疫组织化学染色(IHC)检测50例肝细胞癌(HCC)样本中ALKBH5的表达;采用x2检验分析其与临床特征之间的关系;采用Kaplan-Meier法分析其与患者生存之间的关系;采用GSEA、GO、KEGG和Re-actome通路富集分析预测ALKBH5潜在的作用机制;利用TIMER、TISIDB数据库分析ALKBH5 mRNA与免疫细胞浸润及免疫检查点分子之间的关系.结果:ALKBH5在HCC组织中低表达,并且在肿瘤直径＞5 cm、有包膜浸润、ES分级Ⅲ/Ⅳ级的HCC组织中的表达更低,ALKBH5低表达组患者总生存(OS)和无进展生存(PFS)较差;基因富集分析显示ALKBH5可能参与免疫相关通路,ALKBH5与CD4+T、CD8+T、DC、NK等免疫细胞的浸润相关,与PD-1/L1和CTLA4的表达呈正相关.结论:ALKBH5可能通过影响抗肿瘤免疫促进肝癌恶性进展,导致患者预后不良.

目的:探讨海马神经元线粒体DNA N6-脱氧腺苷甲基化（6mA）在血管性认知障碍中的作用及相关机制。方法:（1）体内实验：采用随机数字表法将SPF级健康雄性大鼠分为假手术组及慢性脑低灌注（CCH）组，每组12只。CCH组大鼠结扎双侧颈总动脉建立CCH模型；假手术组大鼠仅分离双侧颈总动脉，不结扎。2组大鼠于造模后第50天采用旷场实验检测探索能力，第51~53天采用新物体识别试验进行认知功能评估，第54~59天采用Morris水迷宫法检测学习记忆能力。随后处死大鼠检测海马组织ATP浓度及活性氧（ROS）荧光强度并通过TUNEL染色检测海马CA1区神经元凋亡情况。（2）体外实验：HT-22细胞分为正常对照（NC）组、氧糖剥夺（OGD）组、OGD+siControl组、OGD+siMETTL4组。其中NC组正常培养细胞，OGD组给予低糖低氧处理12 h，OGD+siControl组及OGD+siMETTL4组分别给予NC-siRNA、METTL4-siRNA转染细胞后低糖低氧处理12 h。通过透射电镜观察细胞线粒体形态，采用流式细胞术检测细胞ROS荧光强度，通过JC-1荧光染色检测细胞线粒体膜电位，使用试剂盒检测线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ活性。（3）体内及体外实验：采用免疫荧光染色实验及Western blotting实验检测大鼠海马组织神经元线粒体及HT-22细胞线粒体中METTL4及DNA 6mA表达。结果:（1）体内实验：与假手术组比较，CCH组大鼠出现认知障碍表现，表现为旷场实验中进入中心区域次数明显增多，探索新物体时间明显减少，水迷宫实验中穿越平台次数明显减少，逃避潜伏期明显延长，差异均有统计学意义（ P<0.05）。与假手术组大鼠比较，CCH组大鼠海马ATP浓度明显下降[（18.820±1.177）nmol/L vs. （10.190±0.519）nmol/L]，ROS荧光强度明显增加[（4 488.00±255.70）AU vs. （11 644.00±530.20）AU]，差异均有统计学意义（ P<0.05）。TUNEL染色实验结果显示CCH组大鼠海马神经CA1区凋亡神经元数量较假手术组大鼠明显增多。免疫荧光染色结果显示CCH组大鼠海马神经元中6mA及METTL4分布以线粒体为主，表达较假手术组大鼠均明显增加。Western blotting实验结果显示CCH组大鼠海马组织线粒体中METTL4表达较假手术组大鼠明显升高（1.729±0.168 vs. 1.000±0.000），差异有统计学意义（ P<0.05）。（2）体外实验：透射电镜下，与NC组比较，OGD组细胞表现为线粒体嵴消失、膜断裂、空泡化明显。与OGD组细胞比较，OGD+siMETTL4组细胞ATP生成明显增加，ROS生成明显减少，线粒体膜电位明显升高，线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ活性明显增加，差异均有统计学意义（ P<0.05）。细胞免疫荧光染色实验结果显示，OGD组细胞mtDNA 6mA及METTL4表达较NC组明显增加，且两者以在线粒体中表达为著；OGD+siMETTL4组细胞线粒体DNA（mtDNA） 6mA及METTL4表达较OGD组细胞均明显降低。Western blotting实验结果显示，OGD+siMETTL4组细胞中METTL4表达较OGD组明显降低（1.578±0.261 vs. 2.970±0.280），差异有统计学意义（ P<0.05）。 结论:CCH后认知障碍大鼠海马组织神经元线粒体特异性高表达的甲基化酶METTL4促使mtDNA 6mA表达增加，进而导致线粒体能量代谢障碍及ROS升高，可能为血管性认知障碍的机制之一。

[目的]探讨多重耐药假单胞菌属细菌对碳青霉烯类和氨基糖苷类抗生素耐药的分子机制.[方法]选2022 年 1 月至 12 月于本院检验科收到的来自该医院不同病区的 6 株多重耐药恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌.采用 Vitek-2compact全自动鉴定仪和 16s rDNA序列引物鉴定并核实细菌种属.E-test药敏试条法测定菌株对临床抗生素抑菌浓度.PCR扩增和序列对比明确氨基糖苷类和碳青霉烯酶类甲基化酶的基因亚型.[结果]6 株假单胞菌属细菌中有 4 株铜绿假单胞菌、2 株恶臭假单胞菌,均为 Carba NP 阳性,且产碳青霉烯酶;菌株对青霉素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、头孢菌素类、四环素类抗生素均显示为耐药性.6 株菌株中,仅 SY456 为氨曲类耐药,最小抑菌浓度值(MIC值)为 92 μg/mL,而其他菌株均为氨曲类耐药中介或敏感.Carba NP法筛查出 6 株菌均产耐药B类碳青酶烯酶.经与overlap PCR序列比对显示,6 株菌株携带 armA基因和 blaIMP-45 基因,3 株恶臭假单胞菌 SY47、SY153 和 SY434 之间的脉冲场凝胶电泳(PFGE)带型差异显著.[结论]本院存在同时携带armA和 blaIMP-45 的多重耐药恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌,临床医师需根据耐药菌株类型调整用药策略.

目的 本研究分析前列腺癌(PCa)患者外周血DNA腺嘌呤N6甲基化(6mA)修饰的水平,从而探讨6mA修饰与PCa的关系,为PCa寻找新的诊断和预后标志物.方法 分别检测PCa组与对照组的外周血6mA,筛选差异基因6mA热点,通过生物信息学分析方法 ,在全基因组范围对疾病相关位点进行筛选与鉴定.结果 与正常组比较,PCa组中6mA表达上调基因有2 558个,表达下调基因有1 106个,主要分布在内含子上.功能富集与信号通路富集分析结果 显示,钙离子信号通路和T细胞受体信号通路富集倍数最高,此通路中PLCG1、ITPR1、PPP3C和CAMK2等上调基因与上游T细胞受体调控基因共同作用调控钙离子信号转导.结论 钙离子信号通路和T细胞受体信号通路6mA修饰异常可能与PCa的发生、发展相关.

众所周知,DNA的6mA修饰在原核生物中,特别是细菌中发挥重要的作用,它控制着许多重要的生物学过程,但这种DNA碱基修饰在真核生物中的存在与生物学功能一直还不清楚.近来的一系列研究表明,6mA在真核生物中不仅存在,并且可能是真核生物的一种新表观遗传学标记,具有重要的表观调控功能.现对最新的真核生物6mA修饰研究进展进行简要综述,回顾并展望这种真核生物新表观修饰的基本特征、潜在生物学功能及未来的研究方向.

[目的]DNA甲基化是基因修饰的一种重要方式,主要可以形成5-甲基胞嘧啶(5mC)和6-甲基腺嘌呤(6mA)等.目前关于5mC的研究比较多,而关于6mA在真核生物中的研究则较少.沃尔巴克氏体Wolbachia是昆虫中最常见的共生菌之一,可通过多种方式操纵宿主生殖,其中最常见的就是引起精卵细胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility,CI),即感染Wolbachia的雄性与未感染的雌性宿主交配后,胚胎致死,但其机制还不清楚.本研究拟从6mA甲基化的角度,探讨Wolbachia影响果蝇生殖的分子机制.[方法]以模式生物黑腹果蝇Drosophila melanogaster为材料,通过实时荧光定量PCR方法,检测Wolbachia感染对果蝇精巢、卵巢以及3个交配组[TT(对照,父母本都未感染),TW(父本未感染,母本感染,胚胎感染,可发育)和WT(CI,致死)]早期胚胎中DNA 6mA去甲基化酶基因DMAD的表达变化.[结果]Wolbachia感染可显著上调1日龄果蝇精巢中DMAD的表达水平,而对卵巢中DMAD的表达没有显著影响.在产卵后0.5h(中囊胚过渡前)的胚胎中,CI胚胎的DMAD表达水平极显著高于可正常发育的胚胎(TT和TW);在3h的胚胎(中囊胚过渡期)中,TW和CI胚胎中DMAD的表达量都极显著高于对照组;在6h的胚胎(中囊胚过渡后)中,CI胚胎中DMAD的表达量相对最低.[结论]Wolbachia感染可能通过干扰宿主果蝇精巢中6mA甲基化水平对精子产生修饰,导致其与正常未感染的卵子受精后胚胎致死.

目的:建立氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)和高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)分别测定急性早幼粒细胞白血病患者红细胞和血浆中总砷及血浆中无机砷[As(Ⅲ)和As(V)]和甲基化代谢产物(MMA和DMA)的浓度.方法:将患者红细胞和血浆经HNO3-H2 O2的混合物消化处理后,利用HG-AFS法检测血浆和红细胞中总砷的浓度.将患者血浆经高氯酸沉淀蛋白,取上清液进行HPLC-HG-AFS分析,色谱柱为Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱(250 mm×4.1 mm,10μm);以13 mmol·L-1醋酸钠-3 mmol·L-1磷酸二氢钠-4 mmol·L-1硝酸钾-0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠的混合溶液为流动相.结果:总砷的线性范围为0.2～20 ng·ml-1(r=0.9997),4种砷形态的线性范围为2.0～50 ng·ml-1(r>0.9950).红细胞中总砷加样回收率为89.4％～106.3％;血浆中加样回收率为87.6％～100.2％;砷形态加样回收率为81.2％～108.6％.精密度良好.该方法成功应用于5例急性早幼粒细胞白血病患者体内总砷以及砷形态的分析.结论:所建立的方法简便、快速、准确.可应用于急性早幼粒细胞白血病患者血中总砷及砷形态的检测.

目的 探讨肺CT灌注成像与非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤恶性分子表达水平的相关性.方法 64例NSCLC患者为研究组,另选取同期64例肺良性疾病患者为对照组.两组均行肺CT灌注成像检查,并通过免疫组化法测定肺组织微管相关蛋白轻链(MAPLC)3、自噬基因(Beclin)1、增殖细胞核抗原(PCNA)、CD44v6、钙依赖黏附蛋白(E-cad)和干细胞转录因子(OCT4);以酶联免疫吸附法测定血清血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)和DNA甲基化转移酶(DNMT)1水平;以酶联免疫吸附法测定胸膜腔冲洗液醛缩酶(ALDO)A、甲状腺转录因子(TTF)-1和NapsinA水平,分析不同预后患者肺CT灌注成像参数值与肿瘤恶性分子表达水平的相关联.结果 研究组Ⅰ期血容量(BV)值与表面通适性(PS)值显著高于对照组,Ⅱ期BV值与PS值显著高于Ⅰ期,Ⅲ期BV值与PS值显著高于Ⅱ期,Ⅳ期BV值与PS值显著高于Ⅲ期(均P＜0.05).研究组未复发56例,复发8例,复发组PS值及BV值显著高于未复发组(均P＜0.05).研究组MAPLC3、Beclin1、E-cad阳性率及血清PEDF、DN-MT1水平显著低于对照组,PCNA、CD44v6、OCT4阳性率、血清VEGF、胸膜腔冲洗液ALDOA、TTF-1、NapsinA水平显著高于对照组(P＜0.05).BV值、PS值均和ALODA、TTF-1、NapsinA、VEGF、PCNA、CD44v6、OCT4水平呈正相关(P＜0.05),与PEDF、DNMT1、MA-PLC3、Beclin1、E-cad呈负相关(P＜0.05).结论 肺CT灌注成像参数与NSCLC患者肿瘤恶性分子表达水平相关,可为肿瘤分期、预后评估提供参考.

目的 了解铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗生素耐药基因的分布情况.方法 收集临床分离的铜绿假单胞菌,采用仪器法和纸片扩散法(K-B法)进行药敏实验.筛选出对氨基糖苷类抗生素耐药的菌株,用PCR法检测16个氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因和5个16S rRNA甲基化酶基因的表达,进一步对阳性基因扩增产物进行测序验证.结果 54株菌中51 株AMEs基因阳性,检出率为94.4% ,28 株甲基化酶基因阳性,检出率为51.9% .共检出5 种AMEs基因:ant(3″) -Ⅰ、aac(3) -Ⅱc、ant(4′) -Ⅰa、aac(6′) -Ⅰb和ant ( 2″) - Ⅰa,阳性率分别为 66.7% 、 38.9% 、 31.5% 、31.5%和16.6% ;2种16S rRNA甲基化酶基因:rmtB和ar-mA,阳性率分别为29.6%和29.6% ,其余基因均未检出.测序结果与目的基因一致.结论 铜绿假单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药的主要基因为ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱc、ant(4′) -Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb和ant(2″)-Ⅰa以及rmtB, armA.

DNA 甲基化是真核生物的重要表观遗传修饰,如胞嘧啶C5 位甲基化5-甲基胞嘧啶(5mC) 和腺嘌呤N6 位甲基化6-甲基腺嘌呤(6mA).DNA 5mC可经Tet 双加氧酶催化氧化形成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛甲基胞嘧啶(5fC) 和5-羧基胞嘧啶(5caC).这些氧化产物不仅是去甲基化过程的中间体,而且也可能存在各自特有的表观调控功能.其中,5hmC 异常可能和癌症相关,有可能成为疾病诊断的生物标志物.发展可靠、高灵敏和抗干扰能力强的DNA 甲基化和去甲基化检测技术和方法至关重要,有助于理解甲基化和去甲基化的分子机制以及提高肿瘤的诊断水平.现针对DNA 甲基化和去甲基化检测技术进行简要介绍.