目的:通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）技术探讨大鼠周围神经损伤（PNI）模型中单核吞噬细胞（MPs）的分子特征，揭示MPs在PNI后的细胞亚群发展变化及相关的生物学过程。方法:2023年7月至2023年12月于河南省人民医院（郑州大学人民医院）手足显微与创面修复外科及郑州大学第一附属医院骨科选取雄性SD大鼠（体质量200～300 g）27只，根据随机表法将大鼠分为假手术（Sham）组、挤压伤后3 d（3 dpc）组和挤压伤后7 d（7 dpc）组，每组各9只。经7 d环境适应后，对3 dpc和7 dpc组予以右侧坐骨神经卡压以制造卡压伤模型，Sham组仅予以假手术作为对照组。在相应的分组对应时间收集大鼠右侧坐骨神经各9条，制备单细胞悬液，经10X Genomics平台进行单细胞分离，使用Gel Bead Kit V3构建单细胞RNA-seq文库，Illumina Novaseq 6000测序仪对文库进行测序，并利用主成分分析和T分布随机领域嵌入进行降维，获得9个MPs亚群及对应细胞亚群的标记基因，对不同组MPs差异基因进行GO和KEGG分析以揭示其参与的生物学过程。通过Monocle程序进行拟时序分析以揭示损伤后周围神经中MPs发展轨迹。结果:测序中共获取19 054个细胞，结果显示PNI后周围神经中MPs比例显著上调，根据scRNA-seq数据聚类分析将MPs分为9个细胞亚群，分别为亚群1（3 398个细胞）、亚群2（3 388个细胞）、亚群3（3 262个细胞）、亚群4（2 825个细胞）、亚群5（2 753个细胞）、亚群6（1 894个细胞）、亚群7（648个细胞）、亚群8（492个细胞）、亚群9（394个细胞）；根据不同细胞亚群标记物的表达，将坐骨神经Sham组、3 dpc组和7 dpc组中的MPs划分为9种细胞亚群，并鉴定不同MPs亚群在9例坐骨神经样本中的分布。其中，Sham组坐骨神经样本中的MPs细胞数最少（共2 719个），且主要以亚群5（1 119个）、亚群6（1 240个）为主；3 dpc组MPs细胞数最多（共9 760个），且主要以亚群2（1 760个）、亚群3（3 130个）、亚群4（2 300个）为主；7 dpc组MPs（共6 575个）以亚群1（2 406个）、亚群2（1 628个）为主；相较于Sham组，3 dpc组中显著上调DEGs的GO和KEGG注释结果显示，大鼠坐骨神经中MPs在损伤后3 d可能具备与胞外分子结合并清除损伤部位碎片的能力，7 dpc组可能具备激活神经修复相关信号通路的能力；拟时序分析揭示了在未损伤时，MPs主要为亚群5（Ccl17 +Cd80 +）与亚群6（Fcmr +Slc9a9 +）；损伤后3 d时，MPs发展为以亚群2（Cd8b + Meis3 +）、亚群3（Il10 + Cd163 +）、亚群4（Ccl24 + Prg4 +）为主的细胞类型；损伤后7 d时，MPs主要细胞类型中亚群2的效应状态仍得以保持，但其他部分发展为亚群1（Hspa1b +Apobec1 +）相关表型。 结论:通过scRNA-seq数据揭示周围神经中MPs的分子特征，有利于深入了解MPs在PNI后介导炎症反应和神经再生中的作用。

目的:观察沉默载脂蛋白B-mRNA编辑酶复合物3B(APOBEC3B)基因对胰腺癌细胞PATU8988(购自美国典型菌种保藏中心)细胞周期、增殖及侵袭能力的影响。方法:通过构建重组靶向干扰APOBEC3B基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达质粒PGC-shRNA-APOBEC3B沉默APOBEC3B基因。分为空白对照组、阴性对照组及转染组。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞APOBEC3B基因和蛋白的表达变化；流式细胞仪检测细胞周期的变化；平板克隆实验检测细胞增殖；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力。组间比较采用单因素方差分析和LSD- t检验。 结果:APOBEC3B基因和蛋白表达空白对照组为2.28±0.27和3.51±0.32，阴性对照组为2.32±0.21和3.33±0.29，转染组(0.26±0.09和0.31±0.12)明显低于上述两组( t＝6.230、5.640， P<0.01)；细胞周期结果显示G 0/G 1期与S期细胞空白对照组为(55.16±4.19)%、(31.21±1.92)%，阴性对照组为(52.35±3.53)%、(32.17±4.21)%，转染组为(75.12±5.34)%、(13.55±2.01)%，细胞周期阻止于G 0/G 1期( t＝5.230， P<0.01)，S期细胞数减少( t＝5.830， P<0.01)；平板克隆实验显示转染组细胞克隆形成数[(135.77±12.14)个]明显低于空白对照组和阴性对照组[(254.00±12.31)、(247.00±14.51)个， t＝11.210， P<0.01]；穿膜细胞数转染组[(92.41±18.42)个]明显低于空白对照组和阴性对照组[(215.00±23.83)、(227.00±21.25)个， t＝6.480， P<0.01]。 结论:APOBEC3B基因沉默显著抑制SW1990细胞的增殖，减少S期细胞，降低细胞侵袭能力。

目的:研究热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3B, APOBEC3B)抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制过程中的作用及机制。方法:通过免疫共沉淀(co-immunopreciptation，Co-IP)和GST pull-down试验研究HSP70与APOBEC3B的相互作用。干扰HSP70、过表达HSP70或使用HSP70抑制剂VER155008处理肝细胞后，Southern blot或real-time PCR检测APOBEC3B抗病毒作用的改变；差异DNA变性PCR(differential DNA denaturation PCR, 3D-PCR)和克隆测序检测APOBEC3B脱氨酶活性的改变。结果:HSP70能与APOBEC3B相结合，过表达HSP70能增强APOBEC3B的脱氨酶活性和抗HBV功能。相反，干扰HSP70或使用HSP70抑制剂VER155008后，APOBEC3B脱氨酶活性和抗HBV功能均减弱。结论:HSP70通过增强APOBEC3B的脱氨酶活性增强其抗病毒功能。

目的:APOBEC3B(A3B)是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(APOBEC)家族的重要成员，本文旨在探讨其与非小细胞肺癌(NSCLC)预后及顺铂耐受的关系。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析40例NSCLC组织中A3B mRNA的表达，Kaplan Meier plotter分析A3B表达与临床预后的相关性，并在人肺腺癌细胞A549中构建A3B低表达细胞系，通过MTS及平板克隆实验观察细胞顺铂敏感性的改变，γ-H2AX免疫荧光定量检测DNA损伤。结果:与癌旁组织比较，A3B在NSCLC组织中高表达(27/40)，Kaplan Meier plotter分析显示A3B表达与NSCLC总生存率(OS)呈正相关[腺癌： HR＝0.64(0.47－0.86)， P＝0.002 6；鳞癌： HR＝0.77(0.59－1.01)， P＝0.006]。体外实验发现，敲低表达A3B后细胞对顺铂耐药性增强，DNA损伤修复增加。 结论:A3B介导了肺癌对顺铂的敏感性，这一作用可能部分解释A3B高表达的NSCLC患者有更好的预后。

载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(APOBEC)家族中的APOBEC3B是一类具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白.研究表明APOBEC3B可以通过介导体细胞突变参与乳腺癌的发生发展,促进肿瘤转移和耐药,影响乳腺癌的治疗疗效,与乳腺癌的预后关系密切,在乳腺癌的诊断和治疗中具有潜在的临床应用价值,可为乳腺癌的治疗提供新希望.

目的 构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A(APOBEC3A)与不同长度和序列的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的融合蛋白真核表达载体,研究其表达能力及融合蛋白的细胞内定位及胞嘧啶脱氨基活性.方法 采用In-Fusion重组克隆方法,将含有APOBEC3A的PCR产物分别和含有全长HBc、四种C端截短体HBc的PCR扩增片段连接克隆入真核表达载体pcDNA3.0.将重组载体分别转染HEK293T细胞,用免疫荧光细胞化学染色法检测融合蛋白在HEK293T细胞中的定位,Western blot法检测融合蛋白的表达水平;尿素变性PAGE法分析融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性.结果 构建的五种融合蛋白表达载体,可在HEK293T细胞中表达五种融合蛋白,4种含HBc截短体编码的融合蛋白表达载体比含全长HBc编码的融合蛋白载体的表达能力强;含全长HBc的融合蛋白APOBEC3A-HBc主要定位于细胞质,而含HBc截短体的融合蛋白APOBEC3A-HBc144S、APOBEC3A-HBc144E、APOBEC3A-HBc144AAA和APOBEC3A-HBc144A均主要定位于细胞核中;HBc截短体融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性高于全长HBc融合蛋白.结论 成功构建APOBEC3A与不同长度和序列HBc的融合蛋白真核表达载体,APOBEC3A与全长HBc及截短体HBc的融合蛋白在表达能力、细胞内定位以及胞嘧啶脱氨基活性具有明显差异.

20世纪70年代,已有研究证明逆转录病毒可诱发动物白血病,后续研究发现人类基因组有大量内源性逆转录病毒,但是仅在局部地区有逆转录病毒相关的成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)流行.近年来,对APOBEC3(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 3)成员的深入研究阐释了人类对逆转录病毒诱发白血病的抵御机制.EB病毒(Ep-stein-Barr virus,EBV)在人群中广泛传播,以隐性感染形式长期存在于体内,与部分淋巴瘤的发生、发展密切相关,部分实体瘤也与EBV相关,表明其致瘤性.其他病毒感染与人类白血病/淋巴瘤发生、发展的关系,部分可能通过复杂、曲折的网络关系间接相关,大部分还有待于进一步的深入研究.

目的 真核细胞内,DNA甲基化调控在转座子沉默、基因表达调控、甚至病毒感染过程中起关键作用,其中HIV-1启动子的甲基化修饰在病毒潜伏感染中扮演重要角色.为明确载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A (APOBEC3A,A3A)对HIV-1启动子5'LTR上CpG岛甲基化程度的调节作用,本研究构建并筛选出A3A异构体A3A Isotype a(A3A-a)和A3A Isotype b(A3A-b)高表达真核载体,分析其去甲基化功能.方法 从THP-1细胞mRNA中扩增得到A3A-a和A3A-b的cDNA,分别克隆至真核表达载体pASIB-HA和pCAGGS-HA.转染HEK-293T细胞,蛋白印迹法检测A3A-a和A3A-b的蛋白表达,并筛选出A3A-a和A3A-b的高表达载体.接着将A3A-a和A3A-b高表达载体与实验室构建并修饰的HIV-1启动子甲基化载体p-meLTR-EGFP共转染HEK-293T,检测指示蛋白EGFP在细胞水平中的表达,评价A3A-a和A3A-b的去甲基化调节作用.结果 PCR结果、酶切鉴定和测序结果均表明A3A真核表达载体pASIB-HA-A3A1-a、pCAGGS-HA-A3A2-a、pASIB-HA-A3A1-b、pCAGGS-HA-A3A2-b构建成功.经过筛选,pCAGGS-HA-A3A2-a和pCAGGS-HA-A3A2-b中A3A蛋白表达量最高,并用于后续实验.甲基化载体共转染实验显示,相较于对照A3G转染组,A3A-a和A3A-b组中EGFP的表达量明显上调.结论 本研究在细胞水平上证实A3A分子Isotype a和Isotype b均可识别DNA中5-甲基化胞嘧啶,催化HIV-1启动子CpG岛去甲基化,为后续研究A3A对HIV潜伏感染调控奠定了基础.

目的 观察肝脏获得性表达apobec-1对肾病综合征(NS)兔血脂代谢及肝脏低密度脂蛋白受体(LDLR)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)表达的影响,探讨NS兔apobec-1降脂效应及其可能机制.方法 30只健康雄性普通级新西兰兔随机分为假手术组、NS组、apobec-1治疗组,每组10只.NS组、apobec-1治疗组适应性喂养1周后行左肾切除术,术后1周耳缘静脉注射阿霉素(4 mg/kg)构建NS模型;术后11周apobec-1治疗组耳缘静脉注射apobec-1重组腺病毒(1×1013病毒颗粒/kg).术后12周处死所有兔,并摘除右侧肾脏和肝脏,留取血液及24 h尿液,检测24 h尿蛋白(24UPr)、清蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血脂等指标,HE染色观察肾脏病理,Western blot检测肝脏LDLR、LRP蛋白表达水平.结果 1.假手术组、NS组及apobec-1治疗组3组之间比较显示24UPr(F=42.778,P=0.000)、Alb(F=3.819,P=0.034)、BUN(F=6.562,P=0.005)、Cr(F=16.076,P=0.000)、总胆固醇(TC,F=17.531,P=0.000)、三酰甘油(TG,F=6.192,P=0.006)、极低密度脂蛋白(VLDL-C,F=6.192,P=0.006)、低密度脂蛋白(LDL-C,F=34.924,P=0.000)、载脂蛋白B100(ApoB100,F=5.180,P=0.012)、载脂蛋白B48(ApoB48,F=6.161,P=0.006)差异均有统计学意义.2.与假手术组比较,NS组24UPr、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100明显升高,而Alb明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).3.与NS组比较,apobec-1治疗组TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).4.与假手术组比较,apobec-1治疗组24UPr、BUN、Cr明显升高,而Alb、ApoB48明显降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).5.Western blot结果显示3组之间LRP(F=44.180,P=0.000)、LDLR(F=63.141,P=O.000)差异具有统计学意义,与假手术组、NS组比较,apobec-1治疗组肝脏LDLR蛋白表达明显下调(P＜0.01、0.05);LRP蛋白表达明显上调(P均＜0.01).结论 NS肝脏获得性表达apobec-1可通过上调LRP,加速ApoB48-脂蛋白的清除,进而起到一定降脂效应.

目的 观察载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3(APOBEC3s)类胞苷脱氨酶基因家族成员在肝细胞癌(HCC)组织中的表达变化,并探讨其意义.方法 分别采用实时定量PCR和免疫组化法检测155例HCC患者癌组织和癌旁组织中的APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H的mRNA和蛋白.以癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员mRNA相对表达量的中位数为界,将155例HCC患者分为高表达组和低表达组,并分析APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族各成员mRNA相对表达量与HCC预后的关系.结果 HCC患者癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3HmRNA相对表达量分别为4.08±0.11、6.61±0.17、6.42±0.10、5.29±0.12、6.64±0.12、7.49±0.07、4.32±0.08,HCC患者癌旁组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H mRNA相对表达量分别为2.93±0.11、4.60±0.11、5.48±0.11、5.22±0.08、6.97±0.08、5.91±0.12、4.21±0.10,癌组织与癌旁组织中A3A、A3B、A3C、A3G mRNA相对表达量相比,P均<0.05.HCC患者癌组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H蛋白阳性表达率分别为92.3％、96.8％、89.0％、58.1％、69.7％、85.9％、52.9％,HCC患者癌旁组织中APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H蛋白阳性表达率分别为61.3％、63.2％、57.4％、61.9％、74.8％、47.7％、47.7％,癌组织与癌旁组织中A3A、A3B、A3C、A3G蛋白阳性表达率相比,P均<0.05.155例HCC患者癌组织中A3A mRNA低表达者、高表达者5年生存率分别为27.3％、17.7％,两者相比,P<0.05;A3B mRNA低表达者、高表达者5年生存率分别为30.0％、17.1％,两者相比,P<0.05;A3G mRNA低表达者、高表达5年生存率分别为33.6％、13.7％,两者相比,P<0.05.结论 APOBEC3s类胞苷脱氨酶基因家族成员A3A、A3B、A3C、A3GmRNA和蛋白表达水平在HCC癌组织中显著上调,且A3A、A3B、A3G mRNA高表达的HCC患者术后生存率低.