目的:分析深圳市南山区食源性单核细胞增多性李斯特菌（Lm）基因组遗传家系、耐药基因、毒力基因和进化关系的特征性基线信息。方法:对2009—2019年南山区食品中分离的46株Lm进行全基因组提取和二代测序（PE-150，100×），运用CLC Genomics Workbench 12.0软件组装、比对基因组及分析其管家基因、耐药基因、毒力基因和k-mer系统进化关系等特征。结果:46个Lm基因组组装后均满足分析条件（contigs N50>20 kb），平均GC含量为38.3%、预测基因数为5 960个、基因组大小为2 952 608 bp；南山区Lm全基因组k-mer系统发生树可见14簇，总体遗传距离较大，其遗传家系包括21株Lineage 1、23株Lineage 2和2株Lineage 3，Lineage 1以ST87为主，其余为ST3、ST59、ST224和ST429，Lineage 2以ST8和ST9为主，其余为ST121、ST155、ST199、ST204和ST321，Lineage 3只见ST299；发现本地区Lm携带fosX（17株）、tetM（6株）、dfrG（4株）、catB3（1株）和mefA（1株）5种耐药基因，均携带flaA、iap、actA、hly、mpl、prfA、plcA、plcB和inlB 九种毒力基因，同时有6株inlA与3株inlJ发生变异和2株inlC缺失。结论:深圳市南山区分离的食源性Lm呈现遗传进化多样性，携带耐药基因情况较为严重，特别是来源于生禽肉和金针菇的分离株，且功能明确的毒力基因丰富齐全。

目的 了解上海地区支气管扩张症患者铜绿假单胞菌(PA)耐药性和分子流行病学特征.方法 收集分离自上海地区6家医院支气管扩张症患者痰样本的PA 73株.采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗菌药物的敏感性.采用高通量测序(NGS)检测分离菌株的耐药基因,并进行多位点序列分型(MLST).结果 73株PA中,黏液型PA 43株(58.9%).对左氧氟沙星、环丙沙星、亚胺培南的耐药率分别为41.1%、34.2%、12.3%,对其他类抗菌药物的耐药率均<6%.对氟喹诺酮类抗菌药物耐药的PA最主要的突变位点为GyrA的83位和87位、GyrB的466位、ParC的646位和262位、ParE的533位;对亚胺培南耐药的PA膜孔蛋白OprD全部存在突变或缺失.检测到多种获得性耐药基因,包括β-内酰胺类(blaIMP-45、blaPAO、blaOXA-1、blaOXA-50等)、氨基糖苷类[aph(3')-Iib、aac(6')-Ib3、aac(6')-Ib-cr、aadA2b]、磷霉素类(fosA)、氯霉素类(catB7、catB3)、磺胺类(sul1、qacE)和喹诺酮类(crpP).MLST共检测出53个ST型别,最常见的是ST277(5.5%,4/73).结论 上海地区支气管扩张症患者携带的PA大部分为黏液型,总体耐药率较低,但对氟喹诺酮类药物耐药性较高,不存在菌株的克隆传播.

目的 敲除伤寒沙门菌hns基因,分析其对伤寒沙门菌主要毒力基因转录的影响.方法 本研究利用 自杀质粒法与RED重组法敲除伤寒沙门菌hns基因;RED重组法先构建phoPQ基因缺失株(△phoPQ),再敲除hns基因(△phoPQ-hns);提取△phioPQ 与 △phoPQ-hns 的总 RNA,实时定量 RT-PCR 检测毒力基因 hilA、invF、ssrB、ssaB、catB、pltB 的 mR-NA水平,分析HNS对以上毒力基因的调控作用.结果 自杀质粒法与RED重组法均无法直接敲除伤寒沙门菌hns基因;伤寒沙门菌缺失phoPQ基因后,可成功敲除hns基因;△phoPQ-hns中毒力基因hilA、invF、ssrB、ssaB、catB和pltB的mR-NA水平明显高于△phoPQ(均P＜0.01).结论 hns为伤寒沙门菌的毒力负向调控基因,可抑制伤寒沙门菌多个毒力基因的表达.

旨在确定高质量红豆杉中总RNA的提取和纯化工艺条件.以湖南长沙红豆杉叶为材料,以Trizol和CATB两种植物RNA通用提取方法为基础,以RNA的浓度、OD260/OD瑚及OD260/OD230的比值为标准,考察提取方法、提取试剂、提取时间等因素对RNA提取率的影响,优化了红豆杉叶中总RNA的提取方法;通过对比PVP法、p-巯基乙醇法、高盐沉淀法、低浓度乙醇沉淀法、凝胶柱层析法五种不同纯化方法来探讨对红豆杉RNA的影响.考虑到成本的问题,选择使用Trizol法提取红豆杉总RNA,确定了较优的提取条件:红豆杉叶与Trizol提取液的作用体积确定为3:40;裂解时间确定为5 min;氯仿与水液的作用体积确定为1:5.实验表明凝胶柱层析法能显著的提高红豆杉总RNA的纯度并能得到富含miRNA的小分子RNA.最终可得到浓度约为1 000 μg/mL,OD260/OD280在2.00-2.20之间及OD26/OD230大于1.7的高质量RNA样品.与现有的提取方法相比,本方法提取的红豆杉总RNA具有很高的质量和纯度,且大大降低了提取成本,并首次实现了植物总RNA的大量提取.

目的:研孕妇亚甲基四氢叶酸还原酶(M T HFR)基因C677T 多态性与子痫前期的相关性.方法:选择2O14年7月~2O17年3月期间在建始县人民医院诊断为子痫前期的孕妇作为研究的PE组,同期在建始县人民医院产检并分娩的健康孕妇作为研究的对照组.测定外周血中 M T HFR 基因C677T位点的多态性以及同型半胱氨酸(Hcy)代谢指标的含量、凋亡基因及侵袭基因的表达量.结果:PE组孕妇外周血中M T HFR基因C677T位点T T基因型的比例显著高于对照组,CT 及CC基因型的比例均均显著低于对照组;T T 基因型PE孕妇血清及胎盘中Hcy的含量以及胎盘中FasL、Caspase-8、Bax、Caspase-9、Caspase-3的m RN A表达量显著高于C T基因型及CC基因型,血清及胎盘中叶酸的含量以及胎盘中Notch-1、N-cadherin、Vimentin、CatL、CatB的mRNA表达量显著低于CT 基因型及CC基因型PE孕妇.结论:M T HFR基因C677T 位点突变能够通过影响 Hcy代谢以及凋亡基因、侵袭基因表达的方式参与子痫前期的发生.

目的:研究子痫前期患者母体-胎盘循环超声参数与胎盘缺氧及氧化应激程度的相关性.方法:选择在本院进行分娩的子痫前期患者作为研究的 PE组,同期本院分娩的健康孕产妇作为研究的对照组.孕23-26周时行彩色多普勒超声测定子宫螺旋动脉的PI、RI、S/D水平;分娩后收集胎盘并测定缺氧所致细胞凋亡指标、细胞侵袭分子、氧化应激分子的表达量.结果:PE组患者子宫螺旋动脉的PI、RI、S/D水平均显著高于对照组;PE 组胎盘组织中 TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、Nrf-2、HO-1、NQO-1的mRNA表达量显著高于对照组且与子宫螺旋动脉PI、RI、S/D的水平呈正相关,CatL、CatB、uPA、LA M A4的m RNA表达量显著低于对照组且与子宫螺旋动脉PI、RI、S/D的水平呈负相关.结论:子痫前期患者母体-胎盘循环血流阻力增加会造成胎盘缺氧、加剧细胞凋亡及氧化应激.

目的 了解我国4省份禽肉中分离小肠结肠炎耶尔森菌、中间型耶尔森菌和弗氏耶尔森菌的耐药特征和耐药基因的携带情况.方法 本研究采用的22株小肠结肠炎耶尔森菌、2株中间型耶尔森菌和1株弗氏耶尔森菌来源于2016年全国污染物监测网,其中1株分离自宁夏回族自治区, 3株分离自山东省,16株分离自河北省,5株分离自黑龙江省.采用肉汤稀释法测定25株分离菌对14类25种临床常用抗生素的药物敏感性,将菌株的全基因组序列与抗生素抗性基因数据库(ARDB)比对,对基因组中的耐药基因进行预测.结果25株耶尔森菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸和头孢唑啉全部耐药,其中22株小肠结肠炎耶尔森菌中对头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦、呋喃妥因和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药率分别为63.7%(14株)、22.8%(5株)、4.6%和4.6%(1株).25株菌全部耐3类及以上抗生素(多重耐药株),耐4类及以上抗生素的比例为64.0%(16株),且4株分离自鸡肉的小肠结肠炎耶尔森菌对头孢曲松、环丙沙星出现了中介耐药.25株菌株中有20株携带有相同的6种耐药基因(簇),分别为mdtG、ksgA、bacA、blaA、rosAB和acrB,有5株分离自新鲜鸡肉的小肠结肠炎耶尔森菌还携带有耐药基因dfrA1、catB2和ant3ia.结论 我国部分地区生禽肉中耶尔森菌的耐药性严重,携带有多种耐药基因.

目的 探究组织蛋白酶D(CatD)对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物(AGE)的调控作用.方法 分别以CatB+CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂(pepstatin A)、MG-132处理皮肤成纤维细胞,CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性.CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8h,而对照组加入磷酸盐缓冲液(PBS).孵育8h后,置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h,流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度.以不同浓度pepstatin A(37.5、75、150 μmol/L)或PBS处理皮肤成纤维细胞,加入AGE-BSA孵育,方法同前,ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度,计算降解率.慢病毒转染皮肤成纤维细胞,设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组,荧光显微镜观察,RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性.分别加入AGE-BSA孵育,处理及检测方法同前,计算降解率.结果 1μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatinA组及1μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90％以上,与对照组(100％)差异无统计学意义(F=1.525,P＞0.05).去除AGE-BSA 24 h后,CA074Me+ AGE-BSA组和MG-132+ AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度(275.00±10.15、259.00±11.14)均较其相应8h点荧光强度(295.00±6.56、285.67±8.74)显著下降(配对t值分别为4.778、6.154,均P＜0.05),而pepstatin A+AGE-BSA组8h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义(均P＞0.05).37.5、75和150 μmol/LpepstatinA组24 h内对吞人胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64％±1.27％、5.62％±0.47％和3.21％±0.73％,各组间差异有统计学意义(F=45.876,P＜0.05),且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低(P＜0.05).荧光显微镜下观察,空白对照组细胞未见荧光,空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80％以上.CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调(均P＜ 0.05).CatD高表达慢病毒转染+AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染+AGE-BSA组(均P＜0.05).结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA.

目的:研究术前消癌平联合TEC新辅助化疗对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响.方法:选择在本院接受新辅助化疗的乳腺癌患者作为研究对象,随机分为接受术前消癌平联合TEC新辅助化疗的联合组以及接受TEC新辅助化疗的对照组.手术切除后,取乳腺癌病灶并测定增殖基因 、侵袭基因的mRNA表达量以及血管新生分子的蛋白含量.结果:手术切除后,联合组患者乳腺癌病灶内USP39、CyclinD1、c-myc、Sema4D、CatB、ADAM17、uPA的mRNA表达量以及VEGF、Ang-2、bFGF的蛋白含量显著低于对照组,TCEAL17、M FN2、TIM P1、E-cadherin的mRNA表达量以及MMRN2、PEDF的蛋白含量显著高于对照组.结论:乳腺癌术前消癌平联合TEC新辅助化疗能够较单用TEC新辅助化疗能够有效地抑制癌细胞增殖 、侵袭及血管新生.

目的 了解老年病房耐亚胺培南鲍曼不动杆菌携带整合子的情况,分析菌株同源性,为防治院内感染提供依据.方法 收集我院老年科2014年3月至2017年3月临床分离的非重复耐亚胺培南鲍曼不动杆菌28株,采用纸片扩散法确定其耐药率,运用聚合酶链式反应(PCR)法检测整合酶基因(intl)Ⅰ、intlⅡ、intlⅢ及可变区,并用多位点序列分型(MLST)法对其进行分子分型.结果 耐亚胺培南鲍曼不动杆菌intlⅠ的携带率为35.7％,未扩增出Ⅱ类和Ⅲ类intl.整合子阳性菌扩增出两类可变区,分别含有aacC1-orfx′-aadA1及aacA4-catB8-aadA1基因盒.MLST分型提示ST1415型14株(50.0％)、ST1417型5株(17.9％)、ST195型4株(14.3％)、ST540型3株(10.7％),未分型2株.MLST优势基因型为ST1415.结论 耐亚胺培南鲍曼不动杆菌主要携带Ⅰ类整合子,介导对氨基糖苷类、氯霉素耐药.老年病房存在耐亚胺培南鲍曼不动杆菌,尤其是ST1415型的院内感染流行,必须加强感染隔离及控制.