目的:确定肠道病毒A71型(Enterovirus-A71，EV-A71)感染人扁桃体上皮细胞后miRNA表达谱的改变。方法:EV-A71以感染复数为1感染人扁桃体上皮细胞6 h后，采用Trizol提取总RNA，构建小RNA文库，在Illumina NextSeq 500平台进行高通量测序，处理数据后确定差异表达的已知和新型miRNA种类及其靶基因，进行基因本体和信号途径分析；使用psRNATarget预测具有潜在结合EV-A71基因组的差异表达的miRNA种类。实时定量RT-PCR检测差异表达miRNA的变化倍数。结果:通过高通量测序共鉴定61个已知差异表达的miRNA(下调21个、上调40个)和559个新型miRNA，新型miRNA具有典型的前miRNA的二级发卡结构。实时定量RT-PCR确定hsa-miR-517b-3p和hsa-miR-199a-5p的变化倍数与高通量测序结果基本一致。差异表达miRNA靶基因涉及到不同的生物学过程和信号途径。共鉴定出24个差异表达的miRNA(5个已知miRNA，19个新型miRNA)具有与EV-A71结合的潜在"种子序列"。结论:EV-A71感染人扁桃体上皮细胞后引起miRNA表达谱的显著改变，且差异表达的miRNA可能靶向结合EV-A71基因组进而调控EV-A71复制。

目的:研究长非编码RNA（long non-coding RNA，Lnc RNA）RP5-919F19在胃癌组织中的表达及与胃癌侵袭转移的相关性。方法:收集临沂市中心医院2020年1月到2022年1月手术取下的非肿瘤胃黏膜（距癌组织3 cm以上）和胃腺癌组织。应用TRIzol试剂盒提取细胞和组织总RNA，应用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，应用实时定量PCR试剂盒进行定量分析。应用SGC-7901和AGS人胃癌细胞，构建RP5-919F19敲减和过表达模型，应用CCK-8实验确认细胞增殖能力，应用Transwell侵袭实验确认胃癌细胞的侵袭能力。结果:对79例胃癌组织和癌旁正常组织中RP5-919F19表达检测，发现RP5-919F19在胃癌组织中的相对表达量为1.51±0.05，明显高于癌旁正常组织的0.82±0.04（ P<0.05）。对不同病理情况患者的RP5-919F19水平进行对比分析，分析结果显示患者不同TNM分期、是否出现远处转移、淋巴结转移和不同浸润深度患者的RP5-919F19表达差异存在统计学意义（ P<0.05），不同肿瘤大小、年龄和性别患者RP5-919F19表达差异无统计学意义（ P>0.05）。对AGS胃癌细胞转染RP5-919F19过表达和对照质粒，对细胞RP5-919F19效率进行检测，检测结果发现，过表达组细胞的RP5-919F19表达水平为1.83±0.14，相对对照组的0.82±0.05高（ P<0.05），对SGC-7901胃癌细胞转染RP5-919F19敲除和对照载体，对细胞RP5-919F19效率进行检测，检测结果发现，敲除组细胞的RP5-919F19表达水平为0.42±0.07，相对对照组的0.89±0.08低（ P<0.05）。应用CCK-8对胃癌细胞增殖能力进行检测，研究结果显示，RP5-919F19过表达组AGS细胞在培养24 h和48 h的增殖能力均相对对照组有明显提高（ P<0.05），而RP5-919F19敲除组SGC-7901细胞在培养24 h和48 h的增殖能力均相对对照组低（ P<0.05）。Transwell侵袭实验示RP5-919F19过表达组AGS细胞的侵袭和迁移能力均相对对照高（ P<0.05），RP5-919F19敲除组SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均相对对照组低（ P<0.05）。Western blot结果显示，相对于对照组细胞，下调Lnc RNA RP5-919F19 SGC-7901细胞的信号转导蛋白亚基7A（signal transduction protein subunit 7A，COPS7A）蛋白表达降低。 结论:LncRNA RP5-919F19在胃癌组织中表达异常增高，RP5-919F19表达增高会促进胃癌细胞增殖转移。

目的:优化和评估粪便和组织样本高通量测序前处理方法，提高高通量测序在宏病毒组研究中的灵敏度。方法:针对粪便样本，选取经粪便排毒的5种病毒阳性样本混合模拟样本，对不同材质的滤器、核酸酶不同处理时间、不同的提取核酸方法进行评价。针对组织样本，选取动物组织中检出的2种病毒阳性样本，对过滤、核酸酶处理和不同的核酸提取方法进行评价。采用TaqMan real-time PCR定量方法评价每步处理对每一种模式病毒核酸载量的影响，采用SYBR Green real-time PCR方法对细菌16S rRNA基因和宿主12S rRNA基因进行定量以评价细菌和宿主的去除效果。结果:对于粪便样本，使用0.22 μm的PES滤器过滤效果较好，使用PVDF材质滤器导致样本量减少；核酸酶消化2 h比消化1 h去除细菌的效果更好，且病毒损失较少；使用RPMK试剂盒可以有效减少细菌，但对部分病毒提取效果较差，而MVSK试剂盒提取病毒核酸效果较好。对于组织样本，使用0.22 μm的PES滤器过滤病毒损失较少；核酸酶消化1 h可以有效去除宿主gDNA，且病毒损失较少；使用VNAEK II试剂盒提取病毒核酸效果最好，Trizol LS+RPMK方法去除宿主gDNA效果较好，但病毒损失较大。粪便和组织样本的前处理方法整个流程的病毒损失分别为(1.7-3.0)Ct和(1.6-2.5)Ct。结论:粪便样本最佳方法为PES滤器过滤、核酸酶消化2 h、MVSK试剂盒提取核酸；组织样本最佳方法为PES滤器过滤、核酸酶消化1 h、VNAEK II试剂盒提取核酸。

目的:建立转染RNA拯救CVB3的方法，为优化CVB3的分离鉴定和体外培养提供技术参考。方法:比较Qiagen 57704、Qiagen 52904和Trizol三种核酸提取试剂提取CVB3基因组RNA的效率及Lipofectamine 2000和Lipofectamine 3000两种转染试剂转染病毒RNA的效率；探究提取RNA时增加洗脱次数对病毒拯救效率的影响；比较使用HeLa细胞、Vero细胞和HEK293T细胞拯救CVB3的效率。由此确定转染病毒RNA拯救CVB3的最适条件。结果:Qiagen 57704、Qiagen 52904、Tizol试剂盒提取RNA拯救病毒的噬斑数分别为13.33±1.53、150.00±15.00、1.67±0.58，三种方法提取CVB3 RNA拯救病毒RNA的效率差异具有统计学意义( F＝268.920， P<0.001)；Lipofectamine3000、Lipofectamine2000转染病毒RNA形成的噬斑数分别为74.50±3.00、22.00±5.00，差异具有统计学意义( P<0.01)；HEK293T细胞培养病毒拯救CVB3的效率高于HeLa细胞和Vero细胞，三种细胞拯救病毒的拷贝数分别为6.09×10 7±8.00×10 5、5.18×10 3±6.17×10 2、0，差异具有统计学意义( F＝17 383.644， P<0.001)，同时发现提取RNA时通过多次洗脱可以提高病毒拯救的效率。 结论:本研究成功建立了一种优化的转染RNA拯救CVB3的方法，选用Qiagen 52904核酸提取试剂盒、增加洗脱次数、使用Lipofectamine 3000转染试剂、HEK293T细胞转染等方法，可以有效提升病毒的拯救效率。

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)在食管鳞状细胞癌(ESCC)患者外周血中的表达及意义。方法:收集南京市第一医院2015年6月至2018年12月期间早期(Ⅰ～Ⅱ)ESCC患者(组别1)、中晚期(Ⅲ～Ⅳ)ESCC患者(组别2)、正常成人(对照组)血清标本各5例，采用TRIzol试剂提取总RNA，将转录得到的cRNA为模板反转录合成cDNA，纯化后荧光标记并与lncRNA芯片进行杂交。两两比较筛选出相对表达量比值在2倍以上且差异有统计学意义的lncRNA作为差异表达的lncRNA。应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证lnc_TCONS_00011689在ESCC样本中的表达情况，并分析其与ESCC患者临床病理特征及预后的关系，随访日期截止2019年12月31日。应用GraphPad Prism 5.0统计学软件分析，采用配对 t检验和Log-rank生存分析。 结果:在组别1比对照组中上调的lncRNA有1 620条，下调的lncRNA有102条。在组别2比对照组中上调的lncRNA有17条，下调的lncRNA有129条。在组别2比组别1中上调的lncRNA有9条，下调的lncRNA有73条。生信数据分析显示这些差异表达基因的功能与细胞间相互作用、代谢、免疫应答、细胞黏附分子等功能均具有显著相关( r>0.99， P<0.05)。不同组别差异表达的lncRNA与差异表达的mRNA共表达分析显示表达结果中关联度最大的前1 000个关系对( r>0.99， P<0.05)。lnc_TCONS_00011689在ESCC患者血浆中表达与正常人比较明显降低，其在ESCC患者血浆中的表达为5.12±0.31，在正常人血浆中的表达为4.03±0.26，差异有统计学意义( t＝2.187, P<0.05)。lnc_TCONS_00011689与ESCC临床TNM分期呈负相关( t＝2.716， P<0.05)，而与年龄、性别、分化程度以及淋巴结转移均无明显相关( P>0.05)。随访结果显示lnc_TCONS_00011689表达低的ESCC患者总生存期相比于高表达的患者更短( F＝0.048， P<0.05)。 结论:建立不同分期的ESCC患者外周血中差异lncRNA表达谱。lnc_TCONS_00011689可作为食管鳞癌诊断、分期及预后监测的血浆分子标志物。

目的:分析三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)在体外调控小鼠小胶质细胞(BV2)中环状RNA的相关表达。方法:将BV2培养传代后转染病毒，分为低表达GCH1病毒载体组(Ad-shGCH1， n＝3)与对照病毒载体组(Ad-NC， n＝3)两组样本。孵育48 h观察转染效率并利用TRIzol试剂提取总RNA。使用第二代环状RNA(circRNA)高通量测序分析Ad-shGCH1与Ad-NC两组样本，筛选差异表达的环状circRNA。circRNA测序数据使用R包edge R计算基于负二项分布模型的fisher精确检验来确定差异显著性。应用编码-非编码基因共表达(CNC)网络分析对表达差异显著的circRNAs进行生物信息学分析，最后通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证。 结果:与对照组比较，Ad-shGCH1中mmu_circ_0001322(实验组CPM值：10.40，对照组CPM值：7.63， P<0.05)、mmu_circ_0000454(实验组CPM值：10.84，对照组CPM值：8.20， P<0.05)、mmu_circ_0001383(实验组CPM值：10.76，对照组CPM值：8.53， P<0.05)、mmu_circ_0000898(实验组CPM值：11.22，对照组CPM值：9.32， P<0.05)发生高于对照组，差异有统计学意义，mmu_circ_0000652低于对照组(实验组CPM值：7.94，对照组CPM值：10.83， P<0.05)(倍数变化>1.2倍)，差异有统计学意义。CNC分析表明mmu_circ_0000652可能通过参与特定的网络或生物学过程参与调控丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)而发挥作用。 结论:GCH1调控的circRNA可能参与体外小胶质细胞的炎症过程。

目的:探究长链非编码RNA（lncRNA）Xist在腰椎间盘退变（LIDD）髓核组织中的表达及临床意义。方法:Trizol提取法提取LIDD髓核组织细胞及体外培养的髓核细胞总RNA，并通过实时荧光定量PCR验证LIDD髓核组织中lncRNA Xist的相对表达量；体外髓核组织细胞系中，通过转染si-lncRNA Xist构建敲低表达模型，实时荧光定量PCR鉴定敲低效率；EdU染色及流式细胞仪检测细胞增殖行为；Western Blot及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:与对照组比较，LIDD髓核组织中lncRNA Xist的相对表达量升高（ P<0.01）。与正常组比较，TNF-α组EdU阳性细胞数和S期细胞数占比降低（均 P<0.01），凋亡细胞数增加（ P<0.01），Bax蛋白表达水平升高（ P<0.01），Bcl-2水平下降（ P<0.05）；与TNF-α组比较，TNF-α＋siRNA-lncRNA Xist组EdU阳性细胞数和S期细胞数占比增加（均 P<0.05），凋亡细胞数下调（ P<0.05），Bax蛋白表达水平下降，Bcl-2水平升高。 结论:lncRNA Xist在LIDD患者髓核组织中高表达，且抑制髓核细胞增殖，促进凋亡，提示lncRNA Xist可作为LIDD的治疗靶点及潜在生物标志物。

目的:探讨短时低氧处理后表皮细胞HaCaT转录组差异并找出低氧微环境下表皮细胞关键调控基因。方法:本研究分低氧组和常氧对照组，低氧组在1%浓度低氧孵箱中培养30 min，常氧组在常规孵箱中培养30 min，其后采用Trizol法提取总RNA，采用基因芯片技术筛选差异基因，进一步对差异基因采用GO及KEGG Pathway分析关键调控基因。同时采用qRT-PCR对结果进行验证。结果:与对照组相比，低氧微环境处理后表皮细胞上调基因5 416个，下调基因5 060个；GO及KEGG Pathway分析显示差异基因涉及氧化应激、免疫应答、转录因子调控、细胞迁移、信号转导通路及趋化性等。进一步的分析发现，显著调控的基因DDIT3、CCL20以及IL6基因在低氧调控中起着重要作用。同时qRT-PCR验证结果与芯片结果一致。结论:低氧微环境下表皮细胞除氧化应激外，细胞迁移相关基因扮演着重要作用，同时发现表皮细胞能上调基因CCL20以及IL6、下调基因DDIT3在大部分调控中均发挥着重要作用，这些分子对揭示表皮细胞迁移调控及创面愈合机理具有重要的研究价值。

目的 探讨细胞表面受体信号淋巴细胞激活分子家族成员 7(signaling lymphocytic activation molecule family member 7,SLAMF7)在小鼠肠道正常组织和炎症组织中的表达及意义.方法 选择 8～10 周龄C57BL/6J野生型(wild-type)雄性小鼠5只,正常饮用水喂养,提取其结肠固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocytes,LPLs)和肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs),Trizol试剂提取细胞总RNA,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞中SLAMF7的mRNA表达情况.选择8～10周龄C57BL/6J野生型雄性小鼠10 只,随机分为对照组和模型组,每组各5只.对照组用正常饮用水喂养,模型组用含2.5%葡聚糖硫酸酯钠盐(dextran sodium sulfate,DSS)的饮用水喂养,建立小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型.于喂养第5 天处死两组小鼠,采用流式细胞术检测对照组与模型组SLAMF7在免疫细胞亚群中的表达情况.结果 相较于结肠IECs,SLAMF7在结肠LPLs中表达显著升高(P=0.017);DSS诱导肠炎后,SLAMF7在中性粒细胞中的表达上调(P=0.001),在CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、巨噬细胞、经典树突状细胞(conventional dendritic cells,cDCs)中的表达无明显变化(P均＞0.05).结论 SLAMF7可能通过中性粒细胞相关途径在UC的发生发展过程中发挥重要作用.

目的 研究人CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteins,C/EBP β)原核表达载体的构建和蛋白表达,并通过生物信息学分析其结构和生物学功能.方法 收集对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721,通过TRIzol法提取SMMC-7721细胞内总RNA,并以RNA为模板采用RT-PCR获得C/EBP β基因的编码序列,通过同源重组的方法将目的基因与原核表达质粒pET-28a(+)相连接,经过大肠杆菌转化、抗性筛选、质粒提取、酶切和DNA测序获得重组质粒pET-28a(+)-C/EBPβ.将重组质粒导入大肠杆菌BL21中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogal,IPTG)诱导C/EBP β重组蛋白表达,采用镍离子亲和层析法纯化C/EBP β融合蛋白,通过蛋白免疫印迹验证目的蛋白并分析C/EBP β的蛋白纯度.同时对人C/EBP β编码的蛋白质进行理化性质、亲水/疏水性、二级结构以及磷酸化位点等生物信息学分析.结果 通过RT-PCR成功获得人C/EBP β基因,构建的pET-28a(+)-C/EBP β重组质粒经测序鉴定C/EBP β DNA序列完全正确,表明重组pET-28a(+)-C/EBPβ质粒构建成功.C/EBP β蛋白是一个性质不稳定的亲水蛋白质,由345个氨基酸组成,分子量为36.105 kD,等电点为8.55.其是一种胞内蛋白质,主要分布在细胞质和细胞核.对其结构分析发现:无规则卷曲是其主要的二级结构,为60.87％.蛋白免疫印迹结果显示通过亲和层析纯化后获得较高纯度的C/EBP β.结论 本实验成功克隆并构建人pET-28a(+)-C/EBP β重组质粒,获得较高纯度的C/EBP β,为进一步C/EBP β蛋白功能的研究和抗体的制备奠定了良好的基础.