目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性.方法:设置 Cry1Ab 蛋白 7 个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3.通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50％inhibition concentration of growth and viability,IC50).设置Cry1Ab 蛋白 5 个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以 5-FU 为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies,EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50％inhibition concentration of differentiation,ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction,qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5 和 β-MHC)的 mRNA 表达情况.结果:5-FU 的 IC50,3T3为 46.37 μg/L,IC50,ES为 32.67 μg/L,ID50,ES为 21.28 μg/L,根据判别函数结果将 5-FU 分类为强胚胎毒性物质.不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P＞0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P＜0.05),且具有剂量依赖趋势(P＜0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P＜0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:本实验模型中未观察到31.25-2 000.00 μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性.

[目的]棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)对Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性问题是阻碍Bt抗虫棉持续发展的关键,探究棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性演化趋势及交互抗性,可为选择合适的抗虫棉花备选基因提供参考.[方法]在室内通过连续多代筛选,获得了5个对Bt具有不同抗性的品系,利用饲料混合法测定了这些品系棉铃虫的交互抗性.[结果]经筛选后棉铃虫对Cry1Ac产生了超高水平的抗性、对Cry2Ab、Vip3Aa产生了超低抗性(耐性);Cry1Ac抗性棉铃虫停止筛选而换成Cry2Ab或Vip3Aa继续筛选后,棉铃虫对Cry1Ac抗性水平明显降低,对Cry2Ab或Vip3Aa产生低抗或超低抗性(耐性).Cry1Ac抗性棉铃虫对Cry1Ab敏感性显著降低,而对Cry2Ab、Cry2Ah及Vip3Aa敏感性变化不显著;Cry2Ab抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性显著降低;Vip3Aa抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性变化不显著.说明Cry1Ac与Cry1Ab间存在明显交互抗性,与Cry2Ah、Vip3Aa没有交互抗性;而Cry2Ab与Cry1Ac间存在不对称的交互抗性.[结论]在筛选新杀虫基因或叠加基因时,应充分考虑抗性发展及交互抗性问题,Cry2Ah、Vip3Aa是治理Cry1Ac抗性棉铃虫或与Cry1Ac叠加最优的选择.

[目的]系统了解河南省新乡市田间棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)种群对Cry1Ac蛋白的敏感性变化,可为该虫的抗性治理策略提供重要的科学依据.[方法]采用单雌系F1/F2代并结合诊断剂量法于2013-2016年连续监测了河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性基因频率以及种群敏感度的变化.[结果]2013-2016年河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率小于0.00212,抗性基因频率处于较低水平;种群的相对平均发育级别由2013年的0.506分别下降到2015和2016年的0.448和0.442,表明棉铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感度增加.[结论]河南省新乡市棉铃虫种群对转Cry1Ac基因棉花仍处于较为敏感阶段,转Bt基因棉花的种植面积在河南新乡地区的大面积缩小可能是其抗性发展缓慢的重要原因.

While Cry1Ac has been known to bind with larval midgut proteins cadherin,APN (amino peptidase N),ALP (alkaline phosphatase) and ABCC2 (adenosine triphosphate-binding cassette transporter subfamily C2),little is known about the receptors of Cry2Ab.To provide a clue to the receptors of Cry2Ab,we tested the baseline cytotoxicity of activated Cry1Ac and Cry2Ab against the midgut and fat body cell lines of Helicoverpa zea and the ovary cell line ofSpodopterafrugiperda (SF9).As expected,the descending order of cytotoxicity of Cry1Ac against the three cell lines in terms of 50％ lethal concetration (LC50) was midgut (31.0μg/mL) ＞ fat body (59.0μg/mL) and SF9 cell (99.6 μg/mL).By contrast,the fat body cell line (LC50 =7.55μg/mL) was about twice more susceptible to Cry2Ab than the midgut cell line (16.0μg/mL),the susceptibility of which was not significantly greater than that of SF9 cells (27.0μg/mL).Further,ligand blot showed the binding differences between Cry1Ac and Cry2Ab in the three cell lines.These results indicated that the receptors of Cry2Ab were enriched in fat body cells and thus largely different from the receptors of Cry 1Ac,which were enriched in midgut cells.

With the cultivation of Bt cotton,the produced insecticidal Cry proteins are ingested by herbivores and potentially transferred along the food chain to natural enemies,such as predators.In laboratory experiments with Bollgard Ⅱ cotton,concentrations of Cry1Ac and Cry2Ab were measured in Lepidoptera larvae (Spodoptera littoralis,Heliothis virescens),plant bugs (Euschistus heros),aphids (Aphis gossypii),whiteflies (Bemisia tabaci),thrips (Thrips tabaci,Frankliniella occidentalis),and spider mites (Tetranychus urticae).Tritrophic experiments were conducted with caterpillars of S.littoralis as prey and larvae of ladybird beetles (Harmonia axyridis,Adalia bipunctata) and lacewings (Chrysoperla carnea) as predators.Immunological measurements (ELISA) indicated that herbivores feeding on Bt cotton contained 5％-50％ of the Bt protein concentrations in leaves except whiteflies and aphids,which contained no or only traces of Bt protein,and spider mites,which contained 7 times more Cry1Ac than leaves.Similarly,predators contained 1％-30％ of the Cry protein concentration in prey.For the nontarget risk assessment,this indicates that Bt protein concentrations decrease considerably from one trophic level to the next in the food web,except for spider mites that contain Bt protein concentrations higher than those measured in the leaves.Exposure of phloem sucking hemipterans is negligible.

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis生产的晶体毒素被广泛用作农林害虫的杀虫剂.鳞翅目昆虫受体蛋白是阐明其与晶体毒素相互作用的重要模式.文中纯化了苏云金芽孢杆菌的晶体毒素蛋白,质谱鉴定为Cry1Ac毒素,然后重组表达家蚕氨肽酶N (BmAPN6)和类钙粘蛋白(CaLP)结合结构域.利用免疫共沉淀、Far-Western印迹和酶联免疫吸附试验,证明Cry1Ac毒素蛋白和BmAPN6之间的相互作用.在Sf9细胞中,对Cry1Ac毒素的细胞毒活性分析,表明BmAPN6参与Cry1Ac毒素诱导的细胞形态异常和裂解死亡.文中也利用相同的方法,对钙粘蛋白的3个结合位点CR7、CR11和CR12进行相互作用分析,结果表明3个重复结构域是CaLP的Cry1Ac结合位点.上述结果表明,BmAPN6和CaLP可作为CrylAc毒素致病的功能性受体,为进一步揭示晶体毒素的致病机制和基因编辑增强家蚕抗病性提供了研究靶标.

[目的]二化螟是水稻的重要害虫之一,钙黏蛋白(cadherin,CAD)是一类重要的Bt杀虫蛋白受体,在获得二化螟钙黏蛋白基因(CsCAD1)的基础上,明确CsCAD1蛋白与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力.[方法]利用PCR技术克隆CsCAD1基因片段,将构建的pET-28a-(+)-CsCAD1重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.目的蛋白经Ni柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测,利用western blot和ligand blot技术分析其与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力.[结果]重组载体可在表达菌株BL21中表达一个约44 ku的蛋白,原核表达载体构建成功.SDS-PAGE显示该蛋白条带单一,且纯度较好.Ni柱亲和层析纯化该目的蛋白后进行Ligand blot分析,结果显示CsCAD1重组蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合.[结论]CsCAD1蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合,是潜在的Cry蛋白受体,所得结果有助于阐明Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对二化螟的作用机制.

[目的]为探究转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育及其捕食功能的影响.[方法]以转Cry1Ac/1Ab基因棉与其亲本常规棉为实验材料,利用取食不同棉花品种叶片的棉铃虫饲喂异色瓢虫幼虫.[结果]与常规亲本棉相比,取食饲喂转基因棉花叶片的初孵棉铃虫幼虫的异色瓢虫幼虫从1龄发育至化蛹期时间延长0.77 d,但差异不显著;除1龄幼虫体重增加(0.0773 mg)外,其余各龄期幼虫体重均有所下降,但差异均不显著;异色瓢虫1、2、3、4龄幼虫对初孵棉铃虫捕食量均随棉铃虫密度的增加而增加,捕食功能反应均符合HollingⅡ圆盘方程.[结论]转Cry1Ac/1Ab基因棉花对异色瓢虫生长发育无显著影响,饲喂取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花的棉铃虫对异色瓢虫捕食功能无显著差异.

随着转基因技术的飞速发展,越来越多的转基因作物新品种被培育成功并得以推广应用,但转基因作物对非靶标生物的生态安全性问题日益引起人们的广泛关注.为加强转基因作物的生态风险评估,以Cry1Ab纯合基因型转Bt(Bacillus thuringiensis)水稻“克螟稻”和Cry1Ab/Ac融合基因型转Bt水稻“华恢1号”及其对照亲本水稻稻田土壤螨类为研究对象,系统调查研究了纯和基因型和融合基因型转Bt水稻种植下土壤螨类的群落组成、数量动态及其群落多样性的变化.研究结果显示,转Bt水稻对土壤螨类的群落组成无负面影响,仅一些稀有类群(＜1％)和常见类群(介于1％和10％)消失或出现.且与对照亲本相比,纯和基因型转Bt水稻中仅上罗甲螨科(Epilohmanniidae)上罗甲螨属(Epilohmannia)的百分比含量显著增加了525％.此外,转Bt水稻与其对照亲本稻田土壤螨类的数量动态、群落多样性、群落均匀度和科属丰富度之间均差异不显著(P＞0.05).而与纯合基因型转Bt水稻相比,融合基因型转Bt水稻可显著提高大田土壤螨类的数量和科属丰富度(P＜0.05).可见,融合基因型转Bt水稻种植比纯合基因型转Bt水稻更有利于土壤螨类等非靶标生物的发生及其生物多样性保护.

旨在研究多价Bt抗虫转基因水稻的简便有效的检测方法.根据3个Bt转基因事件的插入位置,设计引物,通过多重引物PCR技术,利用9条引物得到6条大小存在明显差异的条带,同时检测3个Bt基因的转基因情况.水稻3个Bt抗虫基因(cry1Ab/Ac、cry2A、cry1C)分别来源TT51-1、T2A-1和T1C-19,其中代表TT51-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为937 bp、718 bp;代表T2A-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为600 bp、434 bp;代表T1C-19事件插入的阳性、阴性条带大小分别为495 bp、792 bp;通过琼脂糖凝胶电泳能快速对转Bt基因插入事件水稻的纯合、杂合、阴性进行检测.该技术克服了多重引物之间可能存在的引物间的相互干扰的技术难度,对不同的PCR试剂有很好的兼容性,可配合水稻DNA的快速提取,迅速对大量选育后代进行分析.该方法的建立为利用多价Bt基因进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便高效的基因检测技术,有助于提高Bt基因检测效率,加快抗螟虫水稻的育种进程.