目的:探讨去泛素化酶（CYLD）在小鼠心肌细胞衰老中的作用及机制。方法:选取野生型FVB（WT）小鼠和CYLD过表达（CYLD +/+）小鼠构建自然衰老模型。2月龄雄性WT小鼠（WT-2M， n=10）和CYLD +/+小鼠（CYLD-2M， n=10）作为年轻组，普通饲养17.5月（WT-17.5M，CYLD-17.5M， n=10）作为年老组。小动物超声检测心功能[左室短轴缩短率（LVFS）、左室射血分数（LVEF）]，蛋白免疫印迹检测心肌组织衰老相关蛋白p53、p21、p16表达水平，实时荧光定量PCR（qPCR）检测心肌组织衰老相关分泌表型（SASP） [细胞因子白介素-1β（IL-1β）、基质金属蛋白酶3（MMP3）、趋化因子CXCL1（CXCL1）]转录水平。转录组测序检测CYLD调控心肌细胞衰老的信号通路，对肿瘤坏死因子α（TNF-α）通路行qPCR验证。 结果:与WT-17.5M小鼠比较，CYLD-17.5M小鼠心功能LVEF和LVFS值增高（均 P<0.05）；p53、p21、p16蛋白表达水平减低（均 P<0.05），IL1B、MMP3、CXCL1转录水平也下降（均 P<0.05）。与WT-2M小鼠比较，WT-17.5M小鼠p53、p21、p16蛋白表达明显升高（均 P<0.01），IL1B、MMP3及CXCL1转录水平上调（均 P<0.01）。转录组测序发现WT-17.5M小鼠较WT-2M小鼠表达上调的信号通路64个，CYLD-17.5M小鼠较WT-17.5M小鼠表达下调的信号通路37个，二者共有的差异信号通路29个。选取TNF-α通路行qPCR验证，WT-17.5M较WT-2M小鼠TNF-α转录水平明显上调（ P<0.05），且高于CYLD-17.5M小鼠（ P<0.05）。 结论:CYLD对心肌自然衰老起保护作用，TNF-α通路介导可能是CYLD保护心肌衰老的作用机制之一。

目的:探讨圆柱瘤基因(CYLD)在非小细胞肺癌中的表达及其对增殖和转移特性的影响。方法:选取2021年6月到2023年12月阜外华中心血管病医院、河南省人民医院和郑州大学人民医院收治的93例非小细胞肺癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析组织中CYLD mRNA表达水平；采用对照慢病毒和CYLD过表达慢病毒感染人非小细胞肺癌H1299细胞系，建立对照组和CYLD组，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、EdU和体外移植瘤分析CYLD对细胞增殖的影响；采用划痕实验、Transwell实验和体外移植瘤分析CYLD对非小细胞肺癌的转移的影响。采用蛋白质印迹法(Western blot)分析CYLD对细胞细胞核增殖抗原(Ki-67)、c-MYC、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和活化因子蛋白1(AP1)蛋白表达水平的影响。组间计量数据比较采用 t检验。 结果:癌旁组织CLYD蛋白表达水平(1.02±0.17)明显高于非小细胞肺癌组织(0.49±0.29)，差异有统计学意义( t＝15.300， P<0.05)。癌旁组织CLYD mRNA表达水平(1.52±0.23)明显高于非小细胞肺癌组织(0.68±0.12)，差异有统计学意义( t＝30.860， P<0.05)。对照组细胞活力[(86.84±6.05)%]明显高于GLYD组细胞[(57.95±3.79)%]，差异有统计学意义( t＝9.909， P<0.05)。对照组细胞EdU阳性率[(82.97±5.65)%]明显高于GLYD组细胞[(49.95±9.43)%]，差异有统计学意义( t＝7.352， P<0.05)。对照组细胞成瘤体积[(919.09±61.86) mm 3]明显高于GLYD组细胞[(639.93±51.24) mm 3]，差异有统计学意义( t＝8.512， P<0.05)。对照组细胞划痕愈合率[(83.49±4.20)%]明显高于GLYD组细胞[(46.71±5.15)%]，差异有统计学意义( t＝13.560， P<0.05)。对照组细胞划痕愈合数[(141.83±11.48)个]明显高于GLYD组细胞[(87.17±7.70)个]，差异有统计学意义( t＝9.686， P<0.05)。对照组细胞体内转移灶[(11.17±2.79)个]明显高于GLYD组细胞[(5.67±2.07)个]，差异有统计学意义( t＝3.884， P<0.05)。对照组细胞细胞Ki-67、c-MYC、Cyclin D1、JNK和AP1蛋白表达水平(0.95±0.10、1.20±0.06、0.93±0.06、1.48±0.09、1.31±0.08)明显高于GLYD组细胞(0.63±0.07、0.81±0.10、0.67±0.12、1.04±0.13、0.63±0.07)，差异有统计学意义( t＝6.612、9.613、4.657、6.724、15.770， P<0.05)。 结论:CYLD在非小细胞癌组织中呈低表达，过表达CYLD可抑制非小细胞肺癌的增殖和转移能力，主要与JNK1信号通路相关。

目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-362-5p对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡的影响及其调控机制.方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测人胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞中miR-362-5p的表达;采用脂质体瞬时转染技术转染miR-362-5p抑制物;噻唑蓝(MTT)法检测miR-362-5p对胃癌细胞株SGC-7901增殖能力的影响;流式细胞术检测miR-362-5p对胃癌细胞周期和凋亡的影响;利用Targetscan信息学预测软件预测miR-362-5p靶向调控Cylindrom-atosis (CYLD)基因,构建携带CYLD野生型及突变型3'非翻译区(3'UTR)野生型和突变型荧光素酶报告载体,并利用双荧光素酶活性分析检测;Western blot检测miR-362-5p对CYLD蛋白表达的调控作用.结果 miR-362-5p在胃癌细胞株SGC-7901、AGS、MKN28的表达水平分别为6.27±0.70、4.63±0.35、5.53±0.45,明显高于胃黏膜细胞(P =0.006、0.003、0.003).转染miR-362-5p抑制物后,胃癌细胞SGC-7901中miR-362-5p表达水平下降[miR-362-5p-IN组(0.41 ±0.07),miR-362-5pNC组(0.84±0.07),P=0.022].下调miR-362-5p后显著抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖[48 h(吸光度值):miR-362-5p-IN组:0.28±0.02,miR-362-5p NC组:0.45±0.04,P=0.028;72 h(吸光度值):miR-362-5p-IN组:0.33±0.02,miR-362-5p NC组:0.61±0.04,P=0.003];下调miR-362-5p后流式细胞术结果显示胃癌细胞G1/Go期比例增加[miR-362-5p-IN组:(78.04±3.74)％,miR-362-5pNC组:(67.86±3.35)％,P=0.017],凋亡增加[miR-362-5p-IN组:(33.29±4.86)％,miR-362-5pNC组:(18.20±0.80)％,P=0.040].双荧光素酶报告基因实验验证CYLD是miR-362-5p的潜在靶基因.Western blot法检测结果显示CYLD蛋白水平与miR-362-5p表达呈负相关.结论 miR-362-5p可通过靶向负调控CYLD蛋白,促进胃癌细胞的增殖,抑制细胞凋亡,进而促进胃癌的发生发展.

目的 研究miR-320a和头帕肿瘤综合征蛋白( CYLD)在胃癌患者中的表达及其与临床病理特征及预后的关系.方法 选取2013年3月—2014年11月在我院行肿瘤切除术的460例胃癌患者作为研究对象,分别收集患者肿瘤组织及癌旁非肿瘤胃粘膜组织,采用荧光定量PCR检测miR-320a和CYLD mRNA表达水平,采用免疫组织化学染色法检测CYLD蛋白表达,分析miR-320a和CYLD表达水平及其与临床病理特征及预后的关系.结果 miR-320a和CYLD mRNA在肿瘤组织中的相对表达量为(0. 37 ± 0. 09)、(0. 91 ± 0. 23),在癌旁非肿瘤组织中的相对表达量为(0. 86 ± 0. 15),(1. 56 ± 0.42),miR -320a 和 CYLD mRNA 在肿瘤组织中的相对表达量与非肿瘤组织比较,差异具有统计学意义(t =60. 078, 29. 113,P<0. 001);CYLD蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率43. 48%与癌旁非肿瘤组织73. 91%比较,差异具有统计学意义(χ2=86. 624,P=0. 003);miR-320a表达水平与患者肿瘤直径和淋巴结转移有关(χ2=25. 859,13. 742,P<0. 05);YLD表达水平与患者TNM分期和肿瘤分化程度有关(χ2=37. 725,59. 323,P<0. 05). miR-320a低表达患者中位生存期(20. 36 ± 0. 56)(95% CI:19. 252~21. 462)与miR-320a高表达患者中位生存期(28. 29个月95% CI:27. 158~29. 412个月)比较,差异具有统计学意义(χ2=87. 967,P<0. 001);CYLD阴性表达患者中位生存期(17. 70个月95% CI:16. 599~18. 796个月)与CYLD阳性表达患者中位生存期(26. 74个月95% CI:25. 474~27. 997个月)比较,差异具有统计学意义( χ2=109. 887,P<0. 001);miR-320a和CYLD共表达患者中位生存期(29. 01个月95% CI:26. 831~28. 946个月)与非共表达患者中位生存期(17. 13个月95% CI:17. 214~19. 568个月)比较,差异具有统计学意义(χ2=117. 680,P<0. 001).肿瘤组织miR-320a与CYLD mRNA表达水平呈正相关(r=0. 607,P<0. 001);miR-320a低表达、CYLD阴性表达、TNM分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度是影响胃癌患者预后的独立危险因素( HR=1. 939、2. 180、1. 561、1. 719、1. 608,95% CI:1. 141~3. 295,1. 252~3. 796,1. 014~2. 403,1. 115~2. 650,1. 097~2. 357,P<0. 05).结论 miR-320a和CYLD在胃癌患者肿瘤组织中表达量明显降低,与疾病发生发展及不良预后有关,是潜在的胃癌诊断及治疗新靶点.

圆柱瘤基因(CYLD)是一种肿瘤抑制基因,其突变或缺失将会导致圆柱瘤的发生.由其编码的去泛素化酶CYLD蛋白是去泛素化酶家族的成员.CYLD通过移除底物蛋白K63连接的泛素链来改变靶分子的功能,并参与核因子κB、JNK和Wnt等信号通路的调控.现就近年CYLD的研究进展,尤其在肝脏相关疾病进展中的负向调控作用进行综述.

脑卒中是目前导致我国人口寿命缩短的最主要原因之一.在缺血性脑卒中的局灶性缺血/再灌注后,受损脑组织中存在多种复杂的病理生理机制,核因子-κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)信号通路参与的炎症反应是重要机制之一.相关研究显示,头帕肿瘤综合征蛋白(cylindromatosis,CYLD)可以参与NF-κdB信号通路的调节.在脑缺血/再灌注损伤中,上调CYLD表达水平,对氧糖剥夺/复氧后NF-κB信号通路是否存在影响？如何影响？尚未见明确报道,这需要我们进一步探究.该研究通过上调CYLD在SD大鼠原代皮质神经元中的表达水平,观察其对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)后神经元中NF-κB信号通路的影响.使用过表达慢病毒感染体外培养的原代皮质神经元,采用免疫荧光实验鉴定神经元,Western blot及RT-qPCR验证CYLD的过表达情况,CCK-8实验检测细胞活力,Western blot检测p-IκBα的蛋白表达情况,RT-qPCR检测NF-κB p65的mRNA表达情况.结果 显示,过表达CYLD慢病毒可有效提高神经元中CYLD的表达水平;过表达CYLD后,较对照组相比,神经元在氧糖剥夺/复氧处理后的活力有所增高,p-IκBα的表达水平有所下降,同时NF-κB p65的mRNA表达水平也明显降低.研究结果表明,在原代皮质神经元中过表达CYLD,能减轻氧糖剥夺/再复氧对神经元的损伤、抑制NF-κB信号通路的激活.

去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)圆柱瘤蛋白(cylindromatosis,CYLD)是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)介导的炎症反应和细胞死亡的重要调节因子,然而CYLD特异性识别底物的机制尚不清楚.本研究通过生物识别(BiolD)筛选得到CYLD的相互作用蛋白——精子发生相关蛋白2(spermatogenesis associated 2,SPATA2),并利用免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)和双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)证实了CYLD与SPATA2的相互作用.SPATA2敲降或敲除抑制了TNF-α诱导的细胞凋亡和程序性死亡,增强了炎症相关基因的表达.机制研究发现,响应TNF-α刺激,SPATA2促进CYLD向肿瘤坏死因子受体信号复合物(tumor necrosis factor receptor signaling complex,TNFRSC)招募和催化受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)去泛素化,进而将TNF-α信号的效果由促炎反应向细胞死亡转变.小鼠模型研究发现,SPATA2敲除小鼠在从出生到成年过程中其生长发育和生殖方面均无明显异常.然而对12～15个月龄小鼠器官的苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和病理形态学分析发现,SPATA2敲除小鼠的结肠和肺部较野生型小鼠出现更为严重的自发性炎症反应,说明SPATA2在体内也具有抑制炎症的功能.本研究揭示了SPATA2通过调控CYLD抑制炎症反应、促进细胞死亡的作用和分子机制,为炎症性相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点.

含NACHT-LRR-PYD结构域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和 Caspase-1组装成的多蛋白复合物,能够诱导IL-1β的成熟与分泌,促进炎症反应发生.它的异常活化可导致多种炎症性疾病.已有研究表明,ASC线性泛素化对炎症小体活化至关重要,但是它是否受去泛素化作用调控尚不清楚.课题组最近研究显示,精子发生相关蛋白2(spermatogenesis-associated protein 2,Spata2)与圆柱瘤蛋白(cylindromatosis tumor suppressor protein,CYLD)组成的去泛素化酶复合物通过去泛素化NLRP3炎症小体上游调节蛋白Polo样蛋白激酶4(Polo-like kinases 4,PLK4)抑制炎症小体活化.研究进一步发现,Spata2-CYLD还可去除ASC的线性泛素化,并确定了泛素化位点及其对ASC活化炎症小体功能的重要性.机制研究显示Spata2-CYLD与ASC在细胞中共定位,并且通过NLRP3蛋白结合至炎症小体发挥去泛素化ASC的作用.研究首次鉴定到ASC的去泛素化酶,揭示了Spata2-CYLD调控NLRP3炎症小体活化的又一新机制,为NLRP3炎症小体活化的调控机制提供了新认识.

骨重建包含破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成,生理状态下二者相互耦联维持骨稳态.越来越多的研究发现泛素蛋白酶途径在骨重建过程中扮演重要角色.泛素化的可逆性是由去泛素化酶实现的,其中,泛素特异性蛋白酶(ubiquitin?specific proteases,USPs)是数量最多的去泛素化酶.目前研究表明,泛素特异性蛋白酶可通过调节成骨细胞、破骨细胞的分化及功能,进而影响骨重建过程.本文总结了USPs调控骨重建的相关机制,包括USP4、USP7等通过调控Wnt/β?catenin等信号通路影响骨形成,圆柱瘤基因(cylindromatosis,CYLD)等通过核因子κB(nuclear factor?kappa B,NF?κB)等信号通路调控骨吸收.除了影响骨重建中的骨吸收与骨形成作用,USPs对骨的影响还体现在人牙周膜干细胞的成骨分化与种植体骨结合方面.未来的研究方向应寻找USPs对骨重建是否具有更多的调节作用,以及其调节作用的具体机制,为治疗骨骼疾病提供更多途径.